Transcript Лекция 1. Бесклеточные системы транскрипции—трансляции

Институт биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ
ТРАНСКРИПЦИИ-ТРАНСЛЯЦИИ: НОВЫЕ
ВОЗМОЖНОСТИ ДЛЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ
ПРОДУКЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ И ИХ
ДОМЕНОВ
Люкманова Екатерина Назымовна
Лаборатория биоинженерии белка,
ИБХ РАН
Биосинтез белка
транскрипция
трансляция
История открытия бесклеточных
белоксинтезирующих систем (ББС)
1950, Winnick – демонстрация возможности белкового синтеза с использованием
экстракта, полученного после разрушения клеток
1958, Roberts – используя отдельные компоненты разрушенной клетки, показана
ключевая роль рибосом, как белок-синтезирующих машин
1960, Lamborg&Zamecnik – создание первых ББС, представляющих собой смесь
неочищенного клеточного экстракта, аминокислот, АТФ и ГТФ.
1963, Nirenberg – удаление эндогенных мРНК из экстракта и внесение экзогенной мРНК
привело к ее трансляции и синтезу целевого белка
1988, Спирин А.С. – создание белоксинтезирующей системы длительного действия
• изучение биосинтеза белка и механизмов его регуляции
• скрининг белков с неизвестными функциями
• белковая инженерия in vitro
• аналитическая и препаративная продукция
рекомбинантных белков
Бесклеточные белоксинтезирующие системы
клеточный экстракт + аминокислоты + экзогенная матрица +
+ энергетические компоненты + система регенерации энергии + кофакторы
=
бесклеточная белоксинтезирующая система
Экстракты:
Приготовление экстракта
Прокариотические
(основанные на экстракте Escherichia coli)
Эукариотические
(на основе экстракта пшеницы, ретикулоцитов
кролика, клеток насекомых или человеческих
клеток)
Компоненты экстрактов:
рибосомы, все ферменты и факторы,
необходимые для транскрипции и трансляции
Imataka et. al., 2011
Бесклеточные белоксинтезирующие системы. Матрицы.
Ионный состав.
• ДНК-независимая ББС
 мРНК
Ионы, важные для работы ББС:
Mg2+, K+, NH4+
• ДНК-зависимая ББС транскрипции-
трансляции
 плазмидная ДНК, содержащая
ген целевого белка и Т7 промотор
 ПЦР-фрагмент, содержащий ген
целевого белка и Т7 промотор
+
Т7-РНК-полимераза
В каждом конкретном случае
требуется
оптимизация по ионному составу и
концентрации матрицы!
Bernhard et al
Бесклеточные системы транскрипции-трансляции.
Пути расходования энергии.
•
•
•
NTP → NDP при транскрипции
GTP → GDP при трансляции
ATP → AMP при присоединении АК к tRNA
Бесклеточные системы транскрипции-трансляции.
Регенерация NTP.
ADP + X-P
фермент
NDP + ATP
НДК
X – фосфоенолпируват COOH,
ATP + X
NTP + ADP
фермент - пируваткиназа
C-О-P
CH2
X – ацетилфосфат
CH3,
фермент - ацетилкиназа
C-О-P
X – креатинфосфат
COOH,
CH2
NH
C-NH2
N-P
фермент - креатинкиназа
Бесклеточные системы транскрипции-трансляции.
Устройство реактора (batch).
0,3
GFP, mg/ml
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
250
300
350
time, min
выход белка ≤ 0.5 мг/мл,
эффективность работы ≤ 2 часа
Бесклеточные системы длительного действия :
диализного типа – CECF (continuous exchange cell-free) (А)
и проточного типа – CFCF (continuous flow cell-free)(Б)
(А) Spirin et. al, Science, 1988
(Б) Endo et al, J Biotech 1992
Компоненты питающей смеси:
ATP, GTP, UTP, CTP,
аминокислоты,
энергетические компоненты
выход белка до 6 мг/мл,
эффективность работы до 24 часов
Преимущества бесклеточных систем синтеза
•
•
•
•
•
•
«Эксклюзивный» синтез целевого
белка с чистотой до 80%
Возможность манипулирования
составом реакционной смеси
«Открытость» системы для
добавления лигандов, кофакторов,
специальных агентов
Низкая цена по сравнению с
бактериальной продукцией
Эффективность по времени (1 день
→ несколько миллиграмм целевого
белка)
Масштабируемость до 100 литров
Maslennikov et. al.,
PNAS, 2010
Бесклеточные белоксинтезирующие
системы
токсичные белки
белки,
содержащие S-S связи
мультимерные
белки
мембранные
белки
белки, содержащие
пост-трансляционные модификации
белки, содержащие
селективные метки
белки, содержащие
неприродные АК
Бесклеточный синтез N-гликозилированных белков
Эукариотические
экстракты
Добавление в ТС
микросом из
клеток
поджелудочной
железы собаки
(Lingappa et al,
PNAS 1978)
Прокариотические
экстракты
Добавление в ТС компонентов из pgl локуса Граммотрицательной бактерии Campylobacter jejuni
продуцированных в E. coli и солюбилизированных в
0.1% DDM
• Фермента олигосахарилтрансферазы (OST, PglB)
• Липид-связанных олигосахаридов (LLO)
(Guarino et al, Glycobiology 2011)
Встраивание эукариотических
N-гликанов возможно требует
использования
модифицированных LLO и
дальнейшего ферментативного
трансгликозилирования
(Schwarz et al, Nat Chem Biol, 2010)
Бесклеточный синтез белков, содержащих S-S связи
Эукариотические
Прокариотические
экстракты
экстракты
Добавление в ТС
глутатиона GSSG
в присутствии
микросом
• Обработка экстракта йодацетамидом (IAM)
• Добавление в ТС глутатионов GSSG/GSH
• Добавление в ТС фермента дисульфид-изомеразы
E. coli (DsbC)
(Scheele et al, JBC 1982)
(Swartz et al, J. Biotechnology, 2011)
(Goerke et al, Biotechnology&Bioengineering 2008)
Бесклеточный синтез белков,
содержащих неприродные АК
Использование мутантных tyrosyl-tRNA синтетазы (TyrRS), и tRNATyr из
археи Methanococcus jannaschii в БСС на основе экстракта E. coli
позволяет встраивать неприродные аналоги тирозина и фенилаланина
по стоп кодону TAG ("amber").
p-acetyl-Lphenylalanine
p-azido-L-phenylalanine
O-methyl-L-tyrosine
(Goerke et al, Biotechnology&Bioengineering 2009)
Бесклеточный синтез мембранных белков (МБ)
•Фармакология
•Медицина
•Промышленные ферменты
•Экология
•Нанотехнологии
Синтез МБ:
a. в виде осадка ТС
b. в присутствии мицелл
детергента
c. в присутствии липидов
С1. в присутствии бицелл
С2. в присутствии
липид-белковых нанодисков
С3. в присутствии липосом
Bernhard et. al., 2010
Использование ББС для структурных исследований МБ
(Junge et al, Cell Mol Life Sci, 2008)
МБ человека, NMR
(Klammt, Maslennikov et al,
Nature methods, 2012)
multidrug
транспортер
EmrE,
X-ray
(Chen et al,
PNAS, 2007)
Бактериальные
рецепторные His
киназы, NMR
(Maslennikov et al,
PNAS, 2010)
Протеородопсин, NMR
(Reckel et al, Angew Chem, 2011)
Пространственные структуры МБ,
полученные в ИБХ РАН
гомодимер ТМ домена
рецептора фактора роста
сосудистого эндотелия
VEGFR2
гомотример мутантного
варианта VEGFR2(V769E)
(Mineev, Arseniev et al, 2013)
гомодимер ТМ домена
рецепторной тирозин
киназы ErbB3 человека
(TM-ErbB3)
(Mineev et al, BBA, 2011)
Бесклеточная продукция МБ в присутствии
липид-белковых нанодисков
EmrE
(multidrug transporter)
Katzen et. al., Trends in Biotech., 2009
Сравнение различных подходов для продукции
мембранных белков в структурированном виде
МБ с различной топологией
• TM-ErbB3 (гомодимерный трансмембранный домен тирозинкиназы человека
ErbB3, 1TM)
• VSD (вольт-сенсорный домен K+ канала KvAP из Aeropyrum pernix, 4TM)
• ESR (бактериородопсин из Exiguobacterium sibiricum, 7TM)
Тестируемые подходы
синтез в присутствии
• детергентных мицелл
• липид-детергентных бицелл
• липид-белковых нанодисков (ЛБН)
• ренатурация из осадка трансляционной смеси
(Lyukmanova et al, BBA, 2012)
Бесклеточная продукция МБ в присутствии мицелл
детергентов
(Lyukmanova et al, BBA, 2012)
Бесклеточная продукция МБ в присутствии мицелл
детергентов
Ни один из
тестируемых
детергентов не
обеспечил синтеза
функционально
активного ESR и
структурированных
TM-ErbB3 и VSD
(Lyukmanova et al, BBA, 2012)
Бесклеточная продукция МБ в присутствии
DMPC/DHPC бицелл
(Lyukmanova et al, BBA, 2012)
Бесклеточная продукция МБ в присутствии
липид-белковых нанодисков
Тестируемый липидный состав ЛБН
1) DMPC
3) POPC
Пустые ЛБН
2) DMPG
4) POPC/DOPG (3:2)
TM-ErbB3
VSD
ESR
Только ЛБН, состоящие из насыщенных липидов,
стабильны при ко-трансляционном встраивании МБ
(Lyukmanova et al, BBA, 2012)
Бесклеточная продукция МБ в присутствии
липид-белковых нанодисков
Ни в одном случае с ЛБН не
удалось синтезировать VSD в
структурированном виде
Для продукции VSD были
разработаны системы
рефолдинга (ренатурации)
из осадка ТС
(Lyukmanova et al, BBA, 2012)
N-концевые белки-партнеры для увеличения
эффективности бесклеточной продукции рецепторов
семейства GPCR
•~ 800 генов в геноме человека (отвечают за рецепцию света, гормонов, запахов,
нейромедиаторов)
•GPCR – мишени для ~ 30% современных лекарственных препаратов
эффективность синтеза GPCR
возросла в 5-38 раз
Патентная заявка РФ,
Люкманова и д.р., Acta Naturae 2012
Ренатурация мускаринового ацетилхолинового
рецептора М1 типа из осадка трансляционной смеси
осадок
трансляционной
смеси
бицеллы
CHAPS/DMPC
солюбилизация
1% SDS
смешанные
мицеллы
DDM/CHS
перевод в подходящую
мембраномоделирующую
среду для ренатурации
мицеллы DPC
ВЭЖХ анализ
эффективности
взаимодействия
с телензипином
липосомы POPC
Бесклеточная продукция ТМ фрагментов
β2-адренорецептора человека (GPCR)
S1/DPC
S2/DPC
S12/HFIP
Преимущества БСС:
• Быстрая наработка (прямая экспрессия)
миллиграммовых количеств гидрофобных
пептидов (ТМ фрагментов МБ)
• Эксклюзивный синтез целевого белка
S1 MERDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTGSHHHHHH
MFERLQTVTNYFITSLAVADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTGSHHHHHH
S2
MERDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTVTNYFITSLAVADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTGSHHHHHH
S12
Бесклеточная продукция потенциалочувствительных
доменов Na+ каналов эукариот
• На ПЧД 2й псевдосубъединицы локализован участок связывания бета-токсинов из яда скорпионов
• Каналы семейства Nav – перспективная мишень для создания новых лекарственных препаратов,
нацеленных на лечение судорожных расстройств, хронической боли, периодического паралича,
миотонии, атаксии и аритмий
• Каналы семейства Nav – мишени для создания новых инсектицидов
ЯМР-исследование ПЧД-Nav1.4
•Исследование 13C 15N-меченого ПЧД-Nav1.4
(5% LPPG, pH 6.0)
•Получен набор 2D и 3D спектров для отнесения
сигналов
•В спектрах наблюдаются ~ 130 спиновых систем
(близко к ожидаемому)
•В настоящее время получено последовательное
отнесение для 63 остатков (~ 40%)
•Наблюдаются нарушения спиральной структуры
«вольт-сенсорной спирали» S4
6
Δδ13Сα
4
S1
S2
S3
S4
S45
2
0
-2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
4
Δδ13С’
2
0
-2
0
10
20
Благодарю за
внимание!