Aspetti generali della Trasduzione del Segnale

Concetti chiave

Specificità Amplificazione Integrazione Interruttori ‘On-Off’ Feedback

Gli organismi multicellulari e in particolare i neuroni hanno GROSSI problemi di comunicazione Hei tu – I tuoi outputs sono troppo deboli!!!

Oi! Abbiamo bisogno di inputs!

?

Per piacere, vuoi smettere di inviare segnali?

Avanti N. 7, adesso devi spegnerti!

I Problemi del Signalling

Le cellule in generale, e i neuroni in particolare, sono esposti a una moltitudine di segnali inclusi quelli provenienti da altre cellule (p.es. segnali derivati da lipidi, piccole molecole organiche o peptidi) così come stimoli ambientali (p.es. luce, calore o variazioni dell’osmolarità) Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti Captare segnali di bassa intensità Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’ intracellulare

Le soluzioni

Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti Recettori con un alto grado di specificità Captare segnali di bassa intensità (ad es. a basse concentrazioni) Recettori ad alta affinità accoppiati ad un sistema di amplificazione Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’ intracellulare Attivazione di vie di signalling disegnate attorno a un limitato numero di processi comuni

Cosa fanno I segnali

Le cellule rispondono ai segnali in una varietà di modi

Alterazione del metabolismo

p.es. Alterazione del metabolismo del glicogeno in risposta all’insulina

Eccitamento

p.es. propagazione dell’impulso nervoso in risposta a neurotrasmettitori

Crescita e Divisione

(mitosi) in risposta a fattori di crescita

Morte cellulare programmata

causata da specifici fattori di ‘morte’ o dalla rimozione di alcuni fattori essenziali

Espressione genica alterata

proteine di membrana in risposta ad un incremento dell’attività sinaptica (plasticità sinaptica) – p.es. Sintesi di nuove

Far attraversare il segnale

Molti segnalatori (p.es. neurotrasmettitori) non possono attraversare la membrana ploasmatica. Le cellule risolvono questo problema utilizzando recettori transmembrana. Questi sono proteine posizionate in membrana con il sito attivo per il ligando* sul lato extracellulare e un dominio intracellulare che si accoppia al passo successivo nella catena di trasduzione del segnale

* Ligando – una molecola che si lega ed è riconosciuta da un recettore

esterno iinterno Dominio di legame extracellulare Membrana plasmatica Dominio transmembrana Dominio intracellulare – si accoppia al passo successivo (può avere attività enzimatica)

Definizione di Recettore

Affinchè una proteina possa essere classificata come recettore (e non una semplice proteina di legame) devono essere soddisfatti diversi criteri

Specificità

– un recettore deve essere in grado di distinguere tra segnali spesso strettamente correlati

Alta affinità

– Le molecole segnalatrici sono spesso presenti a basse concentrazioni – I recettori possono spesso captare concentrazioni tra nM e pM

Saturabilità

– una cellula ha un numero finito di recettori, quindi vi è un limite al numero di molecole di ligando che una cellula può legare

Reversibilità

– l’associazione ligando-recettore non è covalente – quando la concentrazione del ligando diminuisce il complesso può dissociarsi

Accoppiamento

– il recettore trasferisce un segnale dal ligando alla cellula

É quest’ultima caratteristica, più di ogni altra che contraddistingue un recettore da una proteina di legame

Curva di attivazione - Saturazione

k 3 k 1 k 2 (A) Se varia il numero dei recettori presenti si modifica il livello di saturazione della curva (B) Se varia l’affinità del recettore per il messaggero la curva trasla sull’asse delle concentrazioni senza che si modifichi il livello di saturazione.

Risposte iperboliche e sigmoidi

Una risposta sigmoide denota cooperatività e insorge ogni qual volta un recettore (o un enzima) presenta “n” siti di binding per il ligando “s” (n≡coefficiente di Hill è un numero intero >1)

dp dt



V max k m

 

s s dp dt



V max k m n



s n



s n dp dt dp dt

Risposta iperbolica Risposta sigmoide Le risposte sigmoidi sono caratteristiche di molte cascate di signaling, e rappresentano ciò che i biologi chiamano una

risposta ultrasensibile

ad un input.

Una doppia fosforilazione come causa di ultrasensibiltà

Le cascate di MAP kinasi spesso ricevono inputs da molecole di signaling presenti in membrana in risposta a stimoli extracellulari.

Fattore di Crescita MAP chinasi chinasi chinasi

raf ATP ADP

MAP chinasi chinasi

Mek1 ATP ADP

MAP chinasi

Erk1 Come mai sono utilizzate tre kinasi invece di una?

Un importante aspetto del comportamento allo stato stazionario di un sistema di signaling è la forma della curva stimolo-risposta del sistema.

Un esempio molto comune di sistemi che mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi è rappresentato dagli enzimi cooperativi.

[kinasi] in multipli di EC50

Un enzima che mostra sensibilità iperbolica richiede un incremento dello stimolo di input di 81 volte per essere portato dal 10% al 90% di attivazione massima. Al contrario, alcuni enzimi e sistemi di signaling mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi, che spesso sono ben approssimate dall’equazione di Hill: y = x nH /(EC50 + x nH )

Un sistema ultrasensibile richiede un incremento inferiore ad 81 volte nello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di massima attivazione

La cascata delle MAP kinasi esibisce una risposta marcatamente ultrasensibile Erk2=MAPK Mos=MAPKKK [Mos] (nM)

La risposta è marcatamente ripida; mentre un enzima con risposta iperbolica richiede un incremento di 81 volte dello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di attivazione massima, Erk2 (una MAPK) richiede un aumento di circa 2.5 volte Pertanto, c’è qualcosa nel meccanismo a cascata che genera una risposta ad interruttore partendo da stimoli graduali.

La doppia fosforilazione avviene mediante una doppia collisione

MAPKK



P MAPKKK MAPKK

-

P MAPKK-P



P MAPKKK MAPKK

-

PP

a) La MAPKK fosforilata si dissocia dalla MAPKKK b) La seconda fosforilazione richiede una seconda collisione  allora la velocità di conversione della MAPKK fosforilata a doppiamente fosforilata aumenterà con il quadrato della concentrazione dello stimolo La reazione del secondo ordine si traduce in una

curva stimolo-risposta ultrasensibile

con un coefficiente di Hill di 2. Recenti studi indicano che la MAPK è fosforilata mediante un meccanismo a doppia collisione.

Schema di una cascata di MAPK

L’attivazione delle MAPK dipende dalla fosforilazione di due siti nella MAPK. Anche la completa attivazione di MAPKK richiede la fosforilazione di due siti. Qui si assume che le MAPKKK sono attivate e inattivate da enzimi denominati El e E2. MAPKKK* rappresenta la MAPKKK attivata. MAPKK-P e MAPKK-PP rappresentano MAPKK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. MAPK-P e MAPK-PP rappresentano MAPK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. P'ase rappresenta una fosfatasi.

Cinetiche di ordine 1 e zero

Vero ordine zero per v=V max

v



V

max

v



V

max

K m

[

S

] 

k

[

S

]

a) v

in funzione di [S], per un ampio range di [S]

b) v

in funzione di [S], per un ridotto range di [S] dove [S] << K m (~cinetica del 1 ° ordine)

c) v

in funzione di [S], per un range di [S] dove [S] > K m (~cinetica di ordine zero) Per semplicità si è plottato [S’], dove [S’]=[S]/K m

Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta Sensibilità iperbolica kinasi fosfatasi

Un semplice sistema di fosforilazione-defosforilazione: un substrato S è fosforilato da una kinasi per ottenere S-P, che può essere defosforilato da una fosfatasi per riottenere S.

3.5

3 2.5

2 1.5

1 0.5

0 0 [kinasi] 20% 1 2 3 40% 60% 80% S-P come % di S + S-P totale

Si assume che la kinasi e la fosfatasi siano lontani dalla saturazione.

100%

Allora la velocità della reazione verso destra (linea continua) diminuirà e quella verso sinistra (linea tratteggiata) aumenterà, entrambe linearmente (reazione del primo ordine) all’aumentare della percentuale di substrato fosforilato Nel punto di intersezione delle linee tratteggiata e continua il sistema è allo stato stazionario.

Raddoppiando la concentrazione della kinasi:  la pendenza della linea della reazione verso destra raddoppia:

v



k

[

kinasi

]

Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta Sensibilità iperbolica kinasi fosfatasi [kinasi] S-P come % di S + S-P totale

Raddoppiando la concentrazione della kinasi la pendenza della linea della reazione verso destra raddoppia. Adesso la velocità della reazione verso destra sarà superiore a quella della reazione inversa, e il livello di S-P aumenterà. Però, aumentando S-P la velocità della reazione verso destra decadrà e la velocità della reazione inverse aumenterà. Verrà eventualmente raggiunto un nuovo stato stazionario, con il punto di intersezione e la percentuale di S-P allo stato stazionario spostati a destra.

Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta Sensibilità iperbolica

Plottando i livelli di S-P allo stato stazionario del precedente grafico in funzione della [kinasi] si ottiene una curva stimolo-risposta iperbolica

[kinasi] in multipli di EC50

Il sistema è massimamente sensibile (la curva stimolo-risposta ha la massima pendenza) a bassi livelli di stimolo, e diventa progressivamente meno sensibile all’aumentare dello stimolo.

Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta Ultrasensibilità a steps multipli kinasi fosfatasi [kinasi] S-P come % di S + S-P totale

In una reazione di doppia fosforilazione a due steps la velocità della reazione verso destra aumenta con il quadrato dell’ammontare di kinasi presente.



La pendenza della linea della reazione verso destra varia con il quadrato della concentrazione della kinasi presente

v



k

[

kinasi

] 2

[kinasi] in multipli di EC50

La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea continua), con nH=2. La curva sigmoide ha maggiore pendenza di quella iperbolica (linea tratteggiata) per stimoli intorno alla EC50, ma è meno ripida per stimoli molto piccoli e molto grandi.

Ultrasensibilità con cinetica di ordine zero

L’ultrasensibilità può anche insorgere quando la kinasi e la fosfatasi operano

vicino alla saturazione

. In effetti le MAPK sono fisiologicamente presenti a concentrazioni sufficientemente elevate da saturare parzialmente le MAPKK.

[kinasi] S-P come % di S + S-P totale

Se la kinasi e la fosfatasi sono parzialmente saturati, le loro velocità non variano linearmente all’aumentare di S-P: le rette sono sostituite con curve iperboliche.

[kinasi] in multipli di EC50

La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea continua), con nH=2.5. La curva iperbolica è rappresentata dalla linea tratteggiata.

Interruttori di accensione e spegnimento

La maggior parte dei segnali è transitoria e pure la risposta dovrebbe essere transitoria. Se si

accende

un segnale, c’è anche bisogno di una via per

spegnerlo

. Per esempio, il mancato spegnimento di un segnale che fa aumentare la [Ca 2+ ] nel citosol è una delle cause che induce la morte cellulare.

Pertanto, ciò che andiamo cercando sono dei sistemi biochimici in grado di passare rapidamente tra due stati: acceso (on) e spento (off).

In molti sistemi di signalling accensione e spegnimento sono operati da

proteine G

e/o da

proteine di fosforilazione

Interruttori On-Off –Proteine G eterotrimeriche

Il ciclo di base di legame del GTP/GDP nele proteine G eterotrimeriche. è lo stesso di quello delle proteine G monomeriche.

INATTIVA

b La subunità a riassocia a bg si g a GDP GTP GDP GTP a P i a GDP Attività GTPasica della subunità a GTP  GDP+P i Scambio del GDP legato col GTP La subunità a dissocia da bg si

ATTIVA

La subunità a attiva può interagire con lo step successivo della catena di ì signalling e attivarlo

Interruttori On-Off – Proteine G monomeriche

Ras (p21

ras

) è un buon esempio per questo tipo di switch. Ras è una piccola (21 kDa) proteina monomerica che lega il GTP o il GDP e ha un’attività GTPasica intrinseca Il fattore di scambio del nucleotide guanidinico (GEF) interagisce con

ras

Ciò causa lo scambio del GDP legato con il GTP p21 ras

ras

attivata interagisce con il componente successivo della catena di signalling e lo attiva GTP GDP

INATTIVA

p21 ras GDP GTP p21 ras

ATTIVA

P i

Ras

GTPasi stimolata dall’associazione con la GTPase-activating protein (GAP) p21 ras GDP L’attività GTPasica intrinseca idrolizza il GTP a GDP e P i

Attivatori di ras

G-protein Exchange Factors (GEF)

L’attivazione di ras da parte della CaMKII attiva la via delle MAP chinasi •SOS (Son of Sevenless) - Un GEF importante nella regolazione della via della crescita cellulare MAPK/ERK.

ras

•eIF-2b (Eukaryotic Initiation Factor 2) è richiesto per dare inizio alla sintesi proteica. •Ras-GRF1.

Cascata delle MAP chinasi Risposta

Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazione/defosforilazione

Protein Kinasi

– trasferiscono un fosfato dall’ATP ad amino acidi specifici

Protein Fosfatasi

– rimuovono un fosfato da specifici amino acidi O C C C O NH

Serina

ATP H Kinasi Fosfatasi O C

O-fosfoserina

O C C O P NH O O ADP O C C

Fosforilazione

O NH C O P O -

O-fosfoserina

O O P i C C C O H NH

Serina Defosforilazione

Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazione

Kinasi e Fosfatasi fosforilano/defosforilano specifici amino acidi

Amino Acido

Ser & Thr Tyr Thr & Tyr (Doppia specificità)

Kinasi

Protein kinasi C MAP kinasi Recettore per l’EGF pp60 c-src MAP kinasi kinasi

Fosfatasi

PP1 PP2A CD45 AtDsPTP1

Meccanismi di Trasferimento dell’Informazione

Un cambiamento nello stato di attività di un componente a monte porta ad un cambiamento dell’attività di un componente a valle.

•

Il cambiamento può essere attivante o inibente. Esso è interazione-specifico. (p.es. La fosforilazione del target può aumentarne o diminuirne l’attività)

Secondi Messaggeri

Tipicamente composti a basso peso molecolare prodotti all’interno della cellula da un enzima stimolato dal legame di un ligando a un recettore

Adenilato Ciclasi Fosfolipasi C

b

In entrambi questi sistemi il legame di un singolo ligando ad un recettore produrrà un gran numero di molecole di secondo

GTP a Attiva la Protein Kinasi C Attivata dalla subunità a di G s

-

Attivata da recettori legati a G q IP 3

-

Induce un aumento del Ca 2+ citosolico AMP ciclico

un ruolo chiave per i secondi messaggeri

Attiva la Protein Kinasi A

PIP 2 IP 3

– fosfatidilinositolo difosfato – inositolo trifosfato

DAG

- diacilglicerolo

Amplificazione

una molecola di ligando

1 recettore attiva più proteine G AMPLIFICAZIONE Ciascun enzima X produce molti secondi messaggeri, ciascun messaggero attiva 1 enzima Y AMPLIFICAZIONE AMPLIFICAZIONE

Ciascuna kinasi A può fosforilare e attivare molte copie di enzima Z Ciascuna copia di enzima Z produce molte molecole di prodotto proteina recettore

AMPLIFICAZIONE

subunità

a

di G s Adenilato ciclasi attivata AMPc Kinasi A Enzima Z

1 recettore-ligando

Una molecola di rodopsina assorbe un fotone

500 Proteine G 500 enzimi

Sono attivate 500 molecole di trasducina Sono attivate 500 molecole di fosfodiesterasi

2 ndi 10 5 messaggeri 250 canali ionici

Sono idrolizzate 10 5 molecole di GMPc 250 canali del Na vengono chiusi

10 5 -10 7 ioni

Viene prevenuto l’ingresso nella cellula di 10 6 -10 7 ioni Na per secondo per circa un secondo Prodotti dell’ enzima Z La membrana dei bastoncelli è iperpolarizzata di 1 mV

Calcio – il messaggero universale

Il Ca 2+ è mantenuto ad una concentrazione estremamente bassa nel citosol (a causa della sua tossicità), tuttavia la concentrazione del Ca 2+ alta fuori dalla cellula e all’interno di alcuni organelli è L’apertura rapida e transitoria di canali permette al Ca 2+ di fluire nel citosol seguendo il suo gradiente di concentrazione e costituisce la base di un sistema di signalling ubiquitario

Calcio – il messaggero universale

L’attivazione della PLC porta alla formazione di IP acqua 3 solubile in

DAG

PKC PLC L’IP 3 si lega al recettore per l’IP 3 sul reticolo endoplasmatico e apre un canale del Ca 2+ (che fa parte del recettore) La Calmodulina può attivare pompe del Ca 2+ sulla membrana plasmatica abbassando la [Ca 2+ ] citosolico Il Ca 2+ rilasciato dal RE si lega alle Calmoduline permettendole di interagire con altre proteine e attivarle kinasi La Calmodulina può attivare pompe del Ca 2+ del reticolo endoplasmatico abbassando la [Ca 2+ ] citosolico La Calmodulina attiva una vasta gamma di proteine, p.es. kinasi calmodulina-dipendenti

Vie o Networks

Generalmente le

vie

coinvolgono una serie di reazioni a cascata che portano ad un flusso lineare dell’informazione Esempi di vie

1) Vie delle Proteine G 2) Via di Ras –MAPK

I networks (reti) sorgono da interazioni in cui un componente di una via regola l’attività di una seconda via

La via Gq-PLC-

b

Il Ca 2+ si lega alle calmoduline

Chinasi a cascata

L’attivazione di ras da parte della CaMKII attiva la via delle MAP chinasi

ras ras

GTP raf CaMKII La Calmodulina attiva una vasta gamma di proteine, p.es la kinasi II calmodulina-dipendenti Cascata delle MAP chinasi Risposta

Meccanismi a feedback, feedforward e cross-talk

A volte, molecole non direttamente coinvolte in una reazione enzimatica possono interagire allostericamente con l’enzima stesso alterando la conformazione dell’enzima e quindi la sua velocità di reazione.

Quando sono gli stessi substrato o prodotto dell’enzima ad interagire allostericamente con esso, essi possono mediare interazioni a feedback o a feedforward con la via metabolica in cui è coinvolto l’enzima, oppure mediare un cross-talk tra vie metaboliche parallele.

Meccanismi a feedback

In una interazione a feedback, il prodotto di una reazione enzimatica influenza l’attività di un altro enzima che lo precede nella via metabolica.

(A) Feedback negativo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z inibisce l’enzima E1 che catalizza la reazione X  Y.

(B) Feedback positivo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z stimolsa l’enzima E1 che catalizza la reazione X  Y.

Meccanismi a feedforward

In una interazione a feedforward, il prodotto di una reazione enzimatica influenza l’attività di un altro enzima che lo segue nella via metabolica.

Feedforward in uno schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. X stimola l’enzima E2 che catalizza la reazione Y  Z.

Reti di signaling e comunicazione incrociata (cross-talk)

Nel cross talk il metabolita di una via influenza l’attività dell’enzima di un’altra via.

molecole della matrice fattori di crescita kinasi 1 kinasi 2 kinasi 3 Una ipotetica rete di signaling. La rete consiste in sei recettori e tre protein kinasi citosoliche. Ciascun recettore attiva (frecce verdi) o inibisce (linea nera) la kinasi 1 o la 2 o entrambe con un meccanismo non specificato. Poichè i segnali convergono sulla kinasi 3 (la kinasi di output), questa rete si attiverà massimalmente solo quando saranno presenti combinazioni specifiche di stimoli extracellulari.

Segnali multipli – ‘Crosstalk’ di recettori

Immaginate che una cellula riceva due segnali. Il segnale

A

proliferazione, mentre il segnale

B

stimola la proliferazione… inibisce la

A B

-

Il segnale

A

attiva una chinasi… chinasi …che fosforila e inattiva il recettore per il segnale

B

risultato – nessuna proliferazione Se il ‘crosstalk’ lavora solo in una direzione (ad es. da

A

a

B

) allora il segnale

A

sarà dominante Se il ‘crosstalk’ lavora in entrambe le direzioni, ciò che accadrà dipenderà da diversi fattori p.es.

Timing della percezione del segnale Densità relativa dei recettori Ampiezza relativa del segnale

Un crosstalk tra vie del signaling neuronale può influenzare cambiamenti sinaptici indotti da stimoli

In particolare, la capacità della PKC di regolare la MAPK e della MAPK di regolare la PKC porta ad una interazione tra le due vie (feedback pos.) B (basale) stabile T (soglia) metastabile A (attivo) stabile MAPK vs PKC PKC vs MAPK

• Il punto A rappresenta uno stato di

attività alta

sia per la PKC che per la MAPK, mentre il punto B rappresenta uno stato di questo tipo è definito bistabile.

dall’attivazione del recettore.

bassa attività

.

• Entrambi i punti rappresentano livelli diversi di stati stazionari. Un sistema dI • Il punto di biforcazione T è importante perché definisce la soglia di biforcazione.

• Con A viene innescato un loop a feedback positivo che diventa indipendente

Feedback negativo ed oscillazioni

• Quasi tutte le isoforme di adenilato ciclasi (AC) sono regolate dalla via della PLC.

• L’AC è intimamente associata a siti di ingresso del Ca 2+ nella cellula.

• Oscillazioni nei livelli di AMPc intracellulare insorgono a causa di una inibizione a feedback dell’AC Ca 2+ -dipendente.

• Quindi il signalling dell’AMPc si interseca con il Ca 2+ intracellulare ed estende le sue modalità di regolazione.

Feedback negativo ed oscillazioni

Il modello mette in relazione i livelli di AMPc e l’ingresso di Ca 2+ . L’AMPc attiva canali del Ca 2+ (Y). L’ingresso di Ca 2+ aumenta. Il Ca 2+ intracellulare inibisce l’adenilato ciclasi (AC). L’effetto complessivo è un loop a feedback negativo in cui l’AMPc inibisce la sua stessa produzione.

Oscillazioni nell’AMPc e nel Ca 2+ sono sostenute dal loop a feedback negativo.

AMP

  

b ( PDE ) cAMP Ca

2 

ext e



f Ca

2 

int Y C c



d Y O AC h



g AC *

Feedback positivo

Problema

: come può essere immagazzinata informazione, ad es. nel sistema nervoso, partendo da molecole instabili?

Consideriamo ad es. il processo di fosforilazione come un meccanismo di immagazzinamento di informazione.

• La fosforilazione è un meccanismo comune per attivare/disattivare enzimi.

• Supponiamo che un bit di informazione sia stato immagazzinato in un neurone in seguito alla fosforilazione di un enzima chiave attivandolo.

• In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima potrebbe durare a lungo.

In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima potrebbe durare a lungo.

Difficoltà

: In realtà, l’emivita della proteina fosforilata è limitata e quindi anche lo stato “on” dell’enzima.

Quesito centrale

È possibile costruire interruttori molecolari stabili?

Secondo questo articolo è possibile costruire interruttori molecolari in grado di immagazzinare informazione indefinitamente, utilizzando reazioni enzimatiche ben note e in maniera estremamente semplice.

Interruttori molecolari bistabili

Reazioni in un interruttore bistabile.

• • • • L’interruttore è costituito da due proteine: la kinasi-1, che può esistere in uno stato inattivo (K 1 ) o in uno stato attivo (K * 1p ), e una fosfatasi. La transizione tra gli stati inattivo e attivo è dovuta a una reazione di fosforilazione.

La fosforilazione può essere catalizzata dalla kinasi-1 attiva (feedback positivo) o dalla kinasi-2 attivata durante una stimolazione neuronale.

In assenza di attività della Kinasi-2, l’interruttore è descritto da quattro equazioni: Eq. 1 stabilisce che la derivata prima della concentrazione della Kinasi-1 attiva

dK* 1p /dt

, è la differenza tra le velocità di reazione della kinasi e della fosfatasi.

Eq. 2 è la legge di conservazione per la kinasi-1, dove T è la somma della kinasi-1 attiva e inattiva.

Eq. 3 descrive le reazioni della Eq. 1 in termini di cinetiche di Michaelis-Menten, dove K m1 e K m2 sono le costanti di Michaelis per la kinasi-1 e la fosfatasi, rispettivamente; C 1 e C 2 sono i numeri di turnover della kinasi-1 e della fosfatasi, rispettivamente, e P è la concentrazione della fosfatasi.

Eq. 4 è ottenuta sostituendo l’eq.2 nella 3.

Le velocità di reazione della kinasi-1 e della fosfatasi dipendono dalla frazione di kinasi-1 attiva

Velocità (M/s) delle reazioni della kinasi-1 (termine di sinistra nell’Eq. 4) e della fosfatasi (termine di destra nell’Eq. 4) in funzione della frazione dei kinasi-1 attiva (K * 1p /T).

• In assenza di kinasi-1 fosforilata, la velocità di reazione della fosfatasi è zero.

• All’aumentare di K* 1p , la velocità di reazione della fosfatasi aumenta fino alla saturazione.

• La velocità della reazione della kinasi 1 aumenta all’aumentare di K* 1p , ma la velocità decresce nuovamente per concentrazioni elevate di K* 1p perchè vi è poca proteina non fosforilata da fosforilare.

Kinasi Fosfatasi

Grafico della derivata di K* 1p (Eq. 4) rispetto al tempo in funzione di K* 1p /T.

La derivata prima rispetto al tempo della concentrazione di kinasi-1 attiva (

dK* pl /dt

) è la differenza tra le velocità delle reazioni della kinasi e della fosfatasi.

Allo stato stazionario (equilibrio) sara: I punti in corrispondenza di K* 1p /T = 0 e di K* 1p /T  0.74 rappresentano gli stati stabili.

Ad esempio: • se K* 1p /T > 0 ma < 0.22, dK* 1p /dt è negativa e K* 1p ritornerà velocemente a zero; • se K* 1p /T > 0.22 ma < 0.74, dK* 1p /dt è positiva e K* 1p /T aumenterà a 0.74, • se K* 1p /T diventa > 0.74, dK* 1p /dt è negativa e K* 1p /T scenderà verso 0.74.

Stati stabili

Affinchè uno stato sia stabile, deve essere

dK* 1p /dt = 0

e

d 2 K* 1p /dt 2

deve essere negativa. Questa seconda condizione è richiesta affinchè una piccola deviazione da uno stato stabile sia seguita da un ritorno spontaneo a quello stato.

stato instabile

K* 1p /T  0.22

In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati in due punti: K* 1p /T = 0 e K* 1p /T  0.74, mentre K* 1p /T  0.22 rappresenta uno stato instabile.

Affinchè un punto di equilibrio sia stabile, deve essere:

dK* 1p /dt = 0

e

d 2 K* 1p /dt 2

<0 5 d 2 K* 1p /dt 2 0 0.0

0.22

0.2

0.4

dK* 1p /dt 0.6

0.74

0.8

[K 1p ]/[T] 1.0

-5 In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati nei due punti: K* 1p /T = 0 e K* 1p /T  0.74, mentre K* 1p /T  0.22 rappresenta un punto di equilibrio instabile

Soluzioni dell’equazione differenziale: per diverse concentrazioni iniziali di K 1p *

0.74

stato stabile (fosforil.) 0.22

stato instabile 0 stato stabile (defosforil.) Tempo (s)

Le curve convergono verso i due punti stabili K* 1p /T = 0 e K* 1p /T = 0.74 a seconda che la concentrazione iniziale (normalizzata) di K* 1p sia rispettivamente minore o maggiore di 0.22, che rappresenta il punto di

equilibrio instabile

.

L’interruttore può essere acceso permanentemente da uno stimolo esterno Stimolo Kinasi Fosfatasi Funzione neuronale

K* 1p /T K* 2 (nM) Tempo

Effetto della stimolazione sull’interruttore

Stimoli di diversa ampiezza attivano la kinasi-2 in modo graduale. L’attivazione risultante della kinasi-1 è anch’essa graduale

finchè la sua attivazione diviene rigenerativa

. Da quel momento, l’attività della kinasi-1 rimane alta anche quando lo stimolo verrà rimosso.

Meccanismo molecolare del potenziamento a lungo termine

Terminale postsinaptico Terminale presinaptico Sinapsi

PSD Assone Spina Ramo di un dendrite

La “densità postsinaptica o “postsynaptic density” ( PSD ) è una zona specializzata densa di proteine attaccate al lato citosolico della membrana postsinaptica.

• La PSD, caratteristica delle

sinapsi eccitatorie

del SNC, consiste di

recettori ionotropici

,

proteine di sostegno e del citoscheletro

, e

molecole di signaling

.

• Tali proteine creano un

microdominio di signaling

, che traduce inputs presinaptici in risposte postsinaptiche.

• Due sottotipi di

recettori glutamatergici, AMPA ed NMDA

, mediano la la trasmissione eccitatoria rapida.

Trasmissione Sinaptica Potenziamento

Glutamato Glutamato Mg ++ Na + Mg ++ Ca ++ Na + I recettori AMPA forniscono la depolarizzazione della membrana postsinaptica, che a sua volta aiuta l’apertura dei recettori NMDA a generare l’ingresso di Ca 2+ che innesca cascate di signaling.

Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica

Il potenziamento a lungo termine o LTP è una forma sinapsi-specifica di plasticità che potrebbe essere correlata ad alcuni tipi di memoria.

Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca 2+ 0 Tempo (min) 60 Bliss & Lomo J Physiol, 1973

Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica

Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca 2+ con un inibitore della CaMKII non c’è LTP 0 Tempo (min) 60 Lledo et al PNAS 1995, Giese et al Science 1998

*CaMKII a bassa attività: Potenziamento precoce (memoria a breve termine?) Le CaMKII attivate agiscono su proteine preesistenti in attesa di essere attivate. Ad es., fosforilazione di recettori AMPA  risposta postsinaptica più intensa a parità di glutammato liberato

Processi di rilascio fosforilazione AMPAR *CaMKII **CaMKII NMDAR Ca ++ LTP

** CaMKII ad alta attività: Potenziamento tardivo (memoria a lungo termine?)

Premessa

La CaMKII è localizzata nella PSD ed è richiesta per l’induzione di LTP La protein kinasi II Ca 2+ /calmodulina-dipendene (CaMKII) localizzata nella PSD è in una posizione ideale per giocare un ruolo chiave nell’LTP, essendo virtualmente in grado di indurre i processi a valle che potenziano la trasmissione sinaptica.

• L’ingresso transiente di Ca 2+ attraverso canali NMDA, che avviene durante l’induzione dell’LTP, stimola

l’autofosforilazione persistente

e l’

attivazione

della CaMKII.

• L’attivazione persistente della CaMKII suggerisce che essa possa agire come un

interruttore bistabile

responsabile del rafforzamento tutto-o-nulla delle singole sinapsi.

Obiettivo Comprendere il meccanismo di accensione della CaMKII e, in particolare, come la CaMKII possa rimanere in uno stato altamente fosforilato nonostante l’attività delle fosfatasi endogene.

Protein Kinasi II Calmodulina-dipendente

La CaMKII è una proteina multimerica in cui l’oloenzima è costituito da 8 a 12 subunità, ciascuna delle quali ha un’attività kinasica.

Ciascuna subunità è fosforilabile

e il sito di fosforilazione è rappresentato dalla

Thr286

.

La defosforilazione della CaMKII avviene per azione specifica della PP1 trattenuta nel PSD da proteine strutturali.

Un oloenzima = 8/12 subunità

Un dominio autoinibitorio occupa e blocca il sito catalitico.

La Ca 2+ /calmodulina rimuove il dominio autoinibitorio dal sito catalitico causando fosforilazione e attivazione.

Gli oloenzimi di CaMKII formano una struttura ad anello. Negli oloenzimi di CaMKII, le subunità si assemblano in due anelli coplanari, ciascuno contenente 4/6 subunità. In queste strutture ad anello si realizza l’autofosforilazione mediante un processo in cui una subunità fosforila quella accanto.

H 2 N CATALiTICA AUTO INIBITORIA CaM ASSOCIAZIONE ALLE SUBUNITA’ COOH

Meccanismi di bistabilitè del sistema CaMKII/PP1 nel PSD

La CaMKII può trovarsi quindi in uno stato attivato (“on”) nel quale la maggior parte delle 8/12 subunità sono fosforilate a livello della Thr286 e in uno stato disattivato (“off”) nel quale esse sono quasi completamente defosforilate.

Stato “off” Stato “on” Come fa un gruppo di molecole CaMKII e PP1 nella PSD ad operare come un interruttore che presenta due diversi stati stabili a concentrazioni basali di Ca 2+ intracellulare?

L’operazione di attivazione è basata su tre reazioni che possono avvenire ai livelli basali di Ca 2+ .

(1) Se nessun sito Thr286 in un anello è fosforilato, la prima autofosforilazione richiede il legame di

due molecole di Ca 2+ /calmodulina

: una per attivare la subunità catalitica della CaMKII, e l’altra per esporre la Thr286 della subunità adiacente che funge da substrato. P o P o C P o C 2 P 1 C 2 C= complesso Ca 2+ -calmodulina P o =oloenzima non fosforilato P 1 =oloenz. fosforil. una volta Pertanto, la

velocità di autofosforilazione per sito

,

v 1

. dipenderà dalla seconda potenza della [Ca 2+ /calmodulina], che a sua volta dipende dalla quarta potenza della [Ca 2+ ]: (1) v 1 = velocità di inizio dell’autofosforilazione per sito (subunità) k 1 = costante di velocità dello step di autofosforilazione elementare K H1 = [Ca 2+ ] 50 per l’attivazione della CaMKII (0.7 μM, Kuret and Schulman, 1984) [Ca 2+ ] i a riposo (100 nM) << K H1 

l’inizio procederà lentamente alla [Ca 2+ ] di riposo.

(2) Invece, una volta che una o più subunità sono fosforilate, la velocità di fosforilazione della Thr286 diventerà molto più rapida, nonostante la bassa [Ca 2+ ] in , dal momento che è richiesta solo

una molecola di Ca 2+ /calmodulina

per esporre la Thr286 della subunità che funge da substrato.

P 1 P 1 C P 2 Pertanto, la

velocità di autofosforilazione per sito

,

v 2

, della CaMKII parzialmente fosforilata sarà superiore a v 1 , in quanto dipenderà solo dalla quarta potenza della [Ca 2+ ]: 6.E-07 (2) 4.E-07 v1 v2 2.E-07 0.E+00 0 0.04

0.08

[Ca] (m icroM

0.12

(3) I siti della Thr286 della CaMKII vengono defosforilati ad opera esclusivamente della PP1 tenuta nel PSD da proteine di sostegno: il contributo delle altre fosfatasi è minimo in quanto non sono in grado di funzionare nella PSD. La defosforilazione delle subunità procede secondo lo schema di Michaelis-Menten: SP = subunità fosforilata S = subunità defosforilata E = fosfatasi Pertanto, la velocità di defosforilazione per sito della CaMKII parzialmente fosforilata,

v 3

, sarà: (3) k 2 = costante catalitica della PP1 K M = costante di MM e p = concentrazione di PP1 attiva* P i = concentrazione dell’oloenzima fosforilato i-volte.

Quindi, il compartimento biochimico di rilievo è il volume della PSD all’interno del quale la concentrazione delle subunità della CaMKII è 100–200 μM. Se vi è un numero significativamente elevato di subunità fosforilate della CaMKII, la loro concentrazione sarà molto più alta della K M della fosfatasi (1 μM), e vi sarà saturazione della fosfatasi.

Interpretazione intuitiva di come questo sistema chimico può operare da interruttore

• Quando gli oloenzimi CaMKII sono pochissimo fosforilati, la velocità alla quale i siti disponibili diventano autofosforilati è bassa perchè la reazione (1) è lenta.

• Al contrario, la PP1 può rapidamente defosforilare ogni sito fosforilato poichè essa non è saturata (vi sono pochi siti sui quali la PP1 deve intervenire).

• Lo stato “off” è pertanto stabile poichè la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito è

bassa

rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.

• Questa situazione è ribaltata nello stato “on”.

• In questo caso, la reazione della CaMKII è più veloce (essendo richiesta solo una calmodulina per la reazione (2).

• D’altro canto, l’alta concentrazione di subunità fosforilate satura la fosfatasi, e la velocità alla quale essa può defosforilare le varie subunità è pertanto bassa. • Lo stato “on” è quindi stabile essendo la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito

alta

rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.

La simulazione mette in evidenza l’esistenza di un

sistema bistabile

basali che dipende dalle proprietà della fosfatasi presente nel PSD a [Ca 2+ ] in Allo stato stazionario, il livello di fosforilazione delle Thr286 varia con la concentrazione intracellulare di Ca 2+ .

Vi sono due livelli stabili (punti neri) di fosforilazione a [Ca 2+ ] in basali (linea verticale). Il sistema è bistabile in un ampio intervallo di [Ca 2+ ] in (area ombreggiata). Il punto rosso indica la percentuale totale di siti di Thr286 fosforilati dopo che il 20% dell’oloenzima della CaMKII nello stato “on” altamente fosforilato è stato rimpiazzato da oloenzimi non fosforilati. Tale perturbazione non è sufficiente a spingere il sistema nello stato “off”.

Il passaggio del sistema allo stato “off” richiederebbe che la fosforilazione precipitasse al di sotto del livello marcato con il punto giallo (punto di equilibrio instabile). NOTA BENE: La CaMKII nella PSD può essere defosforilata solo dalla PP1.

Un aumento della [Ca 2+ ] in aumenta la frequenza di autofosforilazione.

Se la [Ca 2+ ] in è quella basale (bassa), il grado di fosforilazione allo stato stazionario della CaMKII è basso (cerchio nero nel grafico).

Successivamente, un ingresso di Ca 2+ , causato ad es. da stimolazione elettrica, può muovere transitoriamente la [Ca 2+ ] in verso destra, a valori molto più elevati.

Un aumento della [Ca 2+ ] aumenta la frequenza di autofosforilazione.

Se la [Ca 2+ ] in rimane per un certo tempo elevata, a destra della regione grigia, l’autofosforilazione farà saltare stabilmente l’attività della CaMKII da un livello basso ad uno alto (cerchio nero nel grafico).

Successivamente, quando la [Ca 2+ ] in ritorna a livelli basali, lo stato della CaMKII si riduce, muovendosi verso sinistra. Ma l’attività della CaMKII permane comunque ad un livello alto, con sostenuta autofosforilazione.

FINE