Transcript Presentación - Congreso del Ambiente 2014

Producción de xantófilas a partir de Scenedesmus sp
Autores: Luis A Kieffer1,2, Patricia de la Sierra1,2, Melina Devercelli3, María Claret4, Estefanía Leiz4
1 Facultad de Ingeniería y Ciencias Hídricas (UNL). Ciudad Universitaria. Ruta Nacional N° 168 - Km 472,4. (3000) Santa Fe ; 2 INTEC (UNL – CONICET). Guemes 3450 (3000) Santa Fe; 3INALI (UNL – CONICET).
Ciudad Universitaria. Ruta Nacional N° 168 - Km 472,4. (3000) Santa Fe; 4Fundación VINTEC. Guemes 3450 (3000) Santa Fe - Autor de contacto: [email protected]
Introducción
Extracción y purificación
Las xantofilas, derivados oxigenados de los carotenoides, abundan en los
vegetales aunque también se encuentran en el reino animal (yema de los
huevos). Las mismas son antioxidantes potentes que actúan protegiendo
los tejidos de los daños causados por los radicales libres.
Son utilizadas como suplementos dietarios tanto por su actividad
antioxidante, como por su papel fundamental en las funciones de la
mácula. Las fuentes naturales para su obtención son los pétalos de
caléndula y las microalgas.
Separación de la biomasa del medio de cultivo
Se separaron las algas del medio de cultivo (el cual es reutilizado) por
decantación. Las muestras fueron secadas a 50ºC durante 3 horas con
corriente de aire.
Ruptura de la pared celular
Se compararon diferentes métodos para la ruptura de la pared celular
(molino a bolas, baño de ultrasonido, congelado y descongelado,
grinder y mortero). Los mejores resultados se obtuvieron con mortero.
Cultivo de algas
Saponificación
Las muestras fueron sometidas a tratamiento alcalino con una
solución alcohólica (al 50%) de hidróxido de potasio 4% durante 10
minutos.
Para la obtención de xantófilas se utilizó la especie de algas verdes
Scenedesmus sp. que fue aislada de ambientes acuáticos cercanos a la
ciudad de Santa Fe, siguiendo la metodología estandarizada para
estudios microbiológicos. Se realizaron cultivos a escala laboratorio en 3
sistemas:
1) recipientes de vidrio de 440 ml de capacidad
2) pecera de 25 litros
3) bolsas plásticas de 5 litros.
Diferentes medios de cultivo (Chun 10, Acorinti y Bold Basal), fuentes y
concentraciones de C, N y P, fuentes de luz y temperaturas de
crecimiento fueron analizadas y comparadas.
Los cultivos se mantuvieron en las condiciones elegidas 7 días, durante
los cuales se controló el pH y el crecimiento (por colorimetría a 600 nm).
Se determinó la biomasa final por gravimetría y la producción de
carotenoides mediante HPLC.
Las mejores velocidades de crecimiento se obtuvieron con las siguientes
condiciones: medio de cultivo basal de Bold, modificado para cumplir la
proporción de Redfield utilizando bicarbonato como fuente de carbono y
nitratos como fuente de nitrógeno, iluminación permanente con tubos
fluorescentes y LEDs rojos y azules, temperatura 30ºC, agitación y
ajustando el pH entre 8 y 9.
Extracción
Para la extracción se probaron diferentes proporciones de solventes
(etanol, acetona, acetato de etilo y hexano).
La extracción más eficiente fue con una mezcla de hexano (50%)
acetona (25%) y etanol (25%).
Las muestras saponificadas se extrajeron con la mezcla de solventes
con agitación vigorosa durante 2 minutos y posterior centrifugación.
Luego se realizaron sucesivas extracciones con hexano hasta que la
fase orgánica fue incolora.
Las muestras se concentraron en rotavapor a 40ºC para eliminar el
hexano y luego se redisolvieron en 1 ml de metanol (con 0.01% BHT
para evitar la oxidación). Este extracto se filtró por membrana de
0.2µm y se analizó por HPLC.
Determinación de xantófilas
La concentración de xantófilas (expresados como luteína) se realizó
mediante cromatografía líquida en fase reversa con las siguientes
condiciones:
HPLC Waters 1525,
Columna: C18 (5µm, 4.6 mm x 150 mm),
Fase movil: (A) 90% metanol 10% agua y (B) 90% metanol 10% acetato
de etilo, ambas con 0.05% de trietilamina
Gradiente: 100% (A) durante 4 minutos, gradiente lineal a 100 % (B) en
4 minutos y 100% de (B) durante 7 minutos
Flujo: 1 ml/min
Temperatura de 30 ºC, D
Detector Waters 2487 UV-Vis
Longitud de onda: 450 nm
Resultados y conclusiones
Los mejores rendimientos, alcanzados para 7 días de
crecimiento, fueron de 1g de biomasa por litro de medio de
cultivo. Estos resultados fueron obtenidos con las botellas de
440 ml. Al aumentar la escala, baja la producción (0,7 g/l
para 5 litros y 0,6 g/l para 25 litros) debido a que al
aumentar el volumen la intensidad de iluminación disminuye
por aumento de la longitud de paso y por sombreado de las
mismas algas.
Curvas de crecimiento
1.2
440 ml
1.0
5l
25 l
Absorbancia
0.8
0.6
0.4
La concentración de xantofilas obtenida para las mejores
condiciones de crecimiento fue de 1 mg de xantófilas por g
biomasa.
0.2
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tiempo (días)
Métodos de ruptura de la pared celular
Se logró aislar y cultivar en laboratorio un alga
nativa
que puede ser utilizada para la
producción de xantófilas.
% de recuperación de xantófilas
100
90
Muestra 1
80
Muestra 2
70
Muestra 3
De los métodos estudiados para la ruptura de la pared
celular el que dio mejores resultados fue el mortero
60
50
Se obtuvieron concentraciones de biomasa de
algas y de xantófilas comparables con las
citadas en la bibliografía para producción.
40
30
20
10
0
Sin tratamiento
Baño de
ultrasonido
Congelado y
descongelado
Molino a bolas
Mortero