Apoptose

2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Biologia Celular

Apoptose

     Apoptosis=grego para ‘falling off’ (Caír, desfazer) Processo fisiológico de morte celular programada Processo activo Inibição deste processo é activa e altamente regulada Fases:  A Célula Compacta-se  A membrana forma invaginações  A cromatina condensa   O DNA Fragmenta-se A célula morta divide-se em vesículas membranares (corpos apoptóticos) que são fagocitados

Os processos bioquímicos da apoptose

 Proteólise  Fragmentação genómica  Perda de assimetria da membrana celular  Fragmentação celular www.nih.gov/sigs/Aboutapo.html

Apoptose versus Necrose

       

Apoptose

Determinada genéticamente Ocorre dentro dos intervalos fisiológicos Célula compacata-se Resulta de diversos passos intrinsecamente regulados Participa no equilibrio homeostático do organismo Fenómeno individual celular (suícidio celular) Nunca ocorre perda de estanquicidade membranar As vesículas formadas são removidas por fagocitose, num processo muito rápido que não deixa vestígios        

Necrose

Determinada genéticamente Resulta da alteração súbita de um ou mais intervalos fisiológicos (pH, Temperatura, [iónicas], etc) Citoplasma “incha” Resulta da inviabilização metabólica da célula Não tem funções homeostáticas Fenómeno colectivo a todas as células vizinhas Resulta na perda de estanquicidade da membrana O derramamento do fluido celular inicia processos tecidulares (inflamação) que duram horas ou dias e originam marcas duradouras (cicatrizes)

Controlo da apoptose

   A apoptose em condições biológicas é uma resposta celular a variações subtis    no meio extracelular Na membrana citoplasmática No interior da célula O mesmo estímulo pode desencadear apoptose num tipo de célula, ser inócuo noutro, e desencadear a proliferação noutro A resposta de um tipo de célula a um dado estímulo pode ser variável pois depende de outros factores celulares (ex:fase de maturação) e ambientais (outros estímulos)

Funções da apoptose

 Moldar os tecidos na embriogénese  Eliminar células alteradas (ex. cancro)  Eliminar células que deixaram de ser necessárias (ex. Sistema Imunológico)

Programmed Cell Death

A. Form digits B. Form lumina C. Vestigal structure D. Mullerian/Wolffian E. Cull extras (neurons)* F. Cull immune system* G. Cull damaged cells* *focus of many studies

Anomalias da apoptose

 Malformações congénitas  Doenças Neurodegenerativas  Disfunções imunológicas  Tumores

Apoptose em patologias

   Cancro  Inibição da apoptose      HPV inactiva o promotor do p53 EBV aumenta a produção de bcl-2 Algumas Leucemias B expressam níveis elevados de bcl-2 Melanoma inibe a expressão de Apaf-1 Alguns tipos de cancros do pulmão e do colon secretam uma proteína que bloqueia o FasL  Doenças Auto-imunes  Defeitos na indução de apoptose  Alguns tipos de tumores expressam níveis elevados de FasL induzindo apoptose nas CTL que com elas interactuam Defeitos na selecção celular  Dificuldade em desligar as respostas imunológicas Imunodeficiências  Excesso de apoptose  Deficiências na selecção positiva

Regulação da apoptose

 Estudos em

Caedorhabditis elegans

permitiram identificar 4 grupos de genes:   Responsáveis por desencadear a apoptose Genes envolvidos no processo apoptótico   Genes necessários para a fagocitose dos corpos apoptóticos Genes necessários para a dissolução final dos corpos fagocitados bloqueio Ced-9 detonação apoptose fagocitose dissolução Egl-1, ces-1, ces-2 Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11 Ced-1,ced-2,ced-5, ced-6, ced-7, ced-10 Nuc-1

Apoptose em mamíferos

detonação Egl-1, ces-1, ces-2 bloqueio Ced-9 apoptose Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11 fagocitose Ced-1,ced-2,ced-5, ced-6, ced-7, ced-10 dissolução Nuc-1

A Família bcl-2

Ligação a proteínas de outras famílias Promoção da apoptose Na ausência de BH1 e BH2 Formação de homo/hetero-dimeros Ancoragem à membrana  Three subfamilies  Bcl-2 (survival, 4BH)   Bax (apoptosis, 3BH) BH3 only (apoptosis) BH= bcl-2 homology domain

Apoptose mediada por sinais internos à célula

      A membrana da mitocondria contém bcl-2 ligado a Apaf-1 Dano interno provoca:   Dissociação entre o bcl-2 e Apaf-1 Saída de cyt-c para o citoplasma O cyt-c e o Apaf ligam-se a caspase-9 formando o apoptosoma (com ATP) Os apoptosomas agregam, a caspase-9 inicia uma cascata de activação de caspases por proteólise Degradação de proteínas estruturais do citosol Degradação do DNA nuclear www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html

Apoptose mediana por sinais externos à célula

  Fas e o receptor do TNF são proteínas de membrana constitucionais A ligação de FasL e TNF induz:  Activação de caspase 8  Inicia a cascata de activação de caspases • Degradação de proteínas estruturantes • Degradação do DNA nuclear www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html

Apoptotic Pathways

      Extrinsic pathway the death machinery is triggered by death ligands interacting with DRs to activate initiator caspases. Intrinsic pathway centers on mitochondria which release cyto-c into the cytosol activating caspase cascade.

The extrinsic and intrinsic death pathways can operate singly but crosstalk between the pathways occurs at many levels.

Cyto-c binds Apaf-1 in turn binds to procaspase-9 and activates it and the cascade.

Smac/DIABLO released from mitochondria can bind to IAPs overcoming their inhibition on various caspases. The extrinsic and intrinsic death pathways are linked by the cleavage of Bid by caspase-8.

Cleaved Bid translocates to mitochondria and induces Bax/Bak dependent release of mitochondrial proteins.

Death Receptors

   Modular Structures  CRD=cysteine rich extracellular domain  DD=cytoplasmic death domain Adapters/FADD,etc   contain DDs to interact with receptors and transmit apoptotic signal to machinery Receptors have unique features to recognize ligand with specificity TNFR1/TNF a , lymphotoxin alpha  Fas (CD95)/FasL, DAXX  DR3 & DR4/TRAIL Not Death Receptors  Other TNF members, B & T cell antigens, lack DDs

Executioners of Apoptosis

Caspases: A Common Pathway

 Caspases are proteases involved in 2 stages of the apoptotic pathway  Caspases are synthesized as inactive procaspases that are activated by cleavage to form the active dimer  A complex forms at the receptor that activates caspase-8 to ‘initiate’ the pathway

Caspase Activation

 Synthesized as single chain precursor  Cleavage site at conserved Asp-297  N-peptide contains death-effector domain required to recruit the death receptors (DRs) to the cytosolic face

Caspase Family Members

 Structural features  CARD (caspase recruitment domain  DED (death effector domains) for adaptors  Caspase cleavage  Site separates subunits  Substrate cleavage  caspase cleaves motifs (P1-P4 )in substrates

Pro-apoptotic regulators promote caspase activation

Figure 23-50

Some trophic factors prevent apoptosis by inducing inactivation of a pro-apoptotic regulator

Figure 23-50

Death Machinery

 Initiators of cascade caspases-1,-8, -9, -10  Effectors of cascade caspases-2, -3, -6, -7  Proteins cleaved during execution phase of apoptosis (eg, PARP, lamin A) for irreversible cell death decision

Cysteine Aspartate-specific Proteases

Caspase Caspase-1 Caspase-3 Caspase-8 Caspase-9 Substrates Cleavage motif pro-IL-1beta PARP PARP procaspase-3 YVHD-A DEVD-G* DNA-PK DEVD-N Rb DEAD-G all other pro-caspases DEVD-G* DEVD-G*

Caspase Inhibitors

 Defining motif BIR= baculovirus IAP repeat  Multiple BIR domains  CARD for caspase recruitment domain  RING domain homolog of ubiquitin E3 adaptors

Caspase Inhibitors

 IAPs (inhibitors of apoptosis)  BIR motif necessary/sufficient for anti-apoptotic activity  XIAP, cIAP1, cIAP2 inhibit processing of procaspases-3, 6, 7 by inhibiting cytochrome-c induced activation of caspase-9  FLIPS (FLICE inhibitory proteins)  Contain 2 death effector domains (DEDS)  DEDs interfere with FADD/caspase-8 interaction and activation  Block early events of other death receptors (TNFR1,TRAIL/DR4)  Peptide inhibitors  Synthetic peptide sequences based on substrate binding pocket motif in positions P1-P4 (Ac-YVAD-cho, c-DEVD-cho)

Apoptotic Pathways Converge: Role of Bcl-2 Family

 Extrinsic Pathway:  Ligation of receptors  Adaptor recruitment  Activation of caspase-8  Transmit death signal  Intrinsic Pathway:  Cellular stress (x ray/drug)  Mitochondria integrator  Bcl-2 family regulators  Activation of caspase-9

The Bcl-2 Family Mechanism of Action

 Bcl-2/Bcl-XL/Apaf-1  BH4 of Bcl-2 & Bcl-XL bind to C-term of Apaf-1 inhibiting binding to Casp-9   Bcl-2 and cyto-c  Bcl-2 directly or indirectly prevents release of cyto-c from mitochondria  Bid of BH3 family mediates release of cyto-c c/o PT Bax death pathway  BH1 and BH2 form pores  Death caspase independent

Summary of Bcl-2 Family Roles

Mitochondrial dysfunction

     Many apoptotic stimuli use mitochondrial dysfuntion to signal apoptosis (intrinsic cues)    Steroids Drugs (DNA damage) Irradiation (redox imbal)  Loss of growth factors  Ceramide generation Distinct ‘BH3 only’ proteins respond to specific death stimuli Activated BH3 proteins translocate to mitochondrial surfaces to associate with Bcl-2 related proteins to form membrane-spanning pores Cytochrome c release induces formation of the apoptosome, a ternary complex of cyto-c, Apaf-1 and caspase-9 Apoptosis disrupts mitochondrial membrane potential  PT (permeability transition)

Mitochondrial Permeability Transition

   Effectors of PT  Divalent cations Ca2+    ROS and nitric oxide Conc of some peptides (transport signal sequens) Lipid mediators  Any major change in energy balance (ATP, NAD) or redox state PT functions to integrate stress responses and any major damage of cells will trigger PT.

PT itself causes change in energy and redox balance, when massive, can lock the cell into irreversible stage.

Permeability Transition Pore

      Bcl-2 family members control PTP channel  Bcl-2 proteins in membrane of mitochondria PTP a large pore induced by necrotic or apoptotic signals  OM, outer membrane   IM, inner membrane IMS, inner membrane space PT is achieved by H+ ion gradient generated by electron transport. The H+ gradient is used by the FoF1 synthase to synthesize ATP.

Opening of PTP results in mitochondrial depolarization, uncoupling of oxidat phosphorylation and swelling of mitochondria Direct association between Bax and ANT or Bax and VDAC have been proposed

Role of Mitochondria in Apoptosis

 Releases pro-apoptotic molecules into cytosol upon death stimuli  Apoptosome is formed (Cyto-c,Apaf-1, casp-9)  Opening of PTP can release procasp-2 or -9  Bcl-2 (tethering protein) can regulate activation of mitochondrial pool

Summary of the Players

 Death Pathways  Triggering stimuli  Caspases  Bcl-2 family  Mitochondria  Death by apoptosis vs necrosis

Oncologia

2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Biologia Celular

CANCRO: UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS

    A origem genética dos tumores   Proto-oncogenes e oncogenes Factores de crescimento  Receptores para factores de crescimento   Transdutores intracelulares de sinal Factores de transcrição nuclear  Proteínas de controlo do ciclo celular  Genes de Supressão tumoral Os carcinogénios como mutagénios Agentes virais na origem dos tumores   Oncogenes virais Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes  Activação de proto-oncogenes  Amplificação de proto-oncogene A "estatística" na origem dos tumores

Proto-oncogenes e Oncogenes

 Proto-oncogenes  Genes normais que depois de alterados por mutação originam um fenótipo tumoral  Fazem parte do património genético de todos  Oncogenes  Gene resultante da alteração de um proto oncogene, e que causa um fenótipo tumoral  Fazem parte do património genético das células transformadas

Receptores para factores de crescimento

A GENÉTICA MOLECULAR EM HEMATO-ONCOLOGIA

CANCRO: UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS

 A origem genética dos tumores  Proto-oncogenes e oncogenes  Factores de crescimento  Receptores para factores de crescimento      Transdutores intracelulares de sinal Factores de transcrição nuclear  Proteínas de controlo do ciclo celular  Genes de Supressão tumoral Os carcinogénios como mutagénios Agentes virais na origem dos tumores   Oncogenes virais Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes   Activação de proto-oncogenes Amplificação de proto-oncogene A "estatística" na origem dos tumores    

ANOMALIAS GENÉTICAS EM HEMATO ONCOLOGIA

Translocações cromossómicas em hemato oncologia   Translocações envolvendo genes das Ig ou TCR translocação t(8;14)(q24;q32) e o EBV  A t(14;18) - BCL2/IgH Translocações que originam genes hibridos  t(9;22) - bcr/abl  Delecções cromossómicas em hemato-oncologia Mutações pontuais em hemato-oncologia  t(15;17) - pml/rar mutações no gene p53   

UTILIDADE CLÍNICA DA GENÉTICA MOLECULAR EM HEMATO-ONCOLOGIA

Aprofundamento de conhecimentos Escolha de tratamentos específicos Monitorização da doença

Transdutores intracelulares de sinal

Factores de transcrição nuclear

Proteínas de controlo do ciclo celular (ciclinas)

 O ciclo celular é controlado por ciclinas (cdk), p53 e RB (entre outros factores)   Permite uma sincronia entre o crescimento, duplicação de DNA e divisão nuclear Alterações nos genes das ciclinas podem originar fenótipo tumoral se:  Ocorrer alteração da expressão de uma ou mais ciclinas  se ocorrem mutações nas sequências codificantes dos genes que codificam as ciclinas, o p53 ou o RB

Genes de supressão tumoral

 Genes que suprimem o desenvolvimento de tumores  Mutações germinais associadas com predisposição tumoral  Fenótipo dominante, mas recessivo ao nível celular (a >parte)  O fenótipo depende da inactivação da cópia normal do gene (ex. Retinoblastoma-gene RB, um regulador do ciclo celular)  Fenótipo dominante (casos raros)  O p53 é um estimulador da apoptose que funciona como tetrâmero. Uma diminuição da concentração causada por uma mutação heterózigótica inibe a

Os carcinogéneos como mutagéneos

 Os mutagéneos são substâncias capazes de se interagirem com os ácidos nucleicos, modificnado-lhes propriedades  Se as alterações genéticas resultantes ocorrerem em proto-oncogenes, genes de factores de crescimento, ou genes de supressão tumoral, o genótipo resultante pode ser tumoral

Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes virais

Oncogene Localização Função Oncogenes presentes em vírus de DNA

E1A Nucleo/citoplasma Regula a transcrição E1B PV-ST PV-MT PV-LT Nucleo/citoplasma citoplasma núcleo SV40-ST citoplasma Regula a transcrição membrana citoplasmática liga e estimula pp60 c-

src

e pp62 c-

yes

inicia a síntese de DNA e regula a transcrição SV40-LT núcleo, memb.citoplasm. inicia a sínt.DNA, reg.transcrição, liga p53

Oncogenes presentes em Retrovírus

abl

memb.citoplasm. tirosina cinase

erb

A

erb

B citoplasma membranas receptor da hormona tiroideia tirosina cinase / EGF receptor

ets fes fgr fms

núcleo memb.citoplasm. memb.citoplasm. memb.citoplasm. tirosina cinase tirosina cinase receptor do CSF-1 (tirosina cinase )

raf rel ros sis src ski yes fos fps kit mil/raf mos myb myc

ras núcleo membranas citoplasma citoplasma núcleo núcleo memb.citoplasm. citoplasma citoplasma citoplasma e excretado memb.citoplasm. núcleo tirosina cinase serina/tirosina cinase serina cinase proteina G tirosina cinase subunidade do PDGF tirosina cinase tirosina cinase

Oncogenes não presentes em vírus

bcl bcr int

- linfoma folicular humano - LMC -1,2,3,4 – cancro da mama (rato)

p53

– activo em células transformadas

ret

– Linfoma

rho

– semelhante a

ras met

– linha celular transformada

neu

– neurogliobastoma de rato

Oncogenes virais

Activação e amplificação de proto oncogenes

Translocações envolvendo os genes TCR e Ig

Translocações envolvendo os genes do TCR e das Ig IgH Translocação t(8;14)(q24;q32) t(11;14)(q13;q32) t(14;18)(q32;q21) t(14;19)(q32;q13) TCR-ß t(3;14)(p27;q32) t(5;14)(q31;q32) IgK t(2;8)(p12;q24) Ig  TCR a t(2;3)(p12;q27) t(8;22)(q24;q11) t(3;22)(q27;q11) t(1;14)(p32;q11) t(10;14)(q24;q11) t(11;14)(p14;q11) t(11;14)(p13;q11) t(8;14)(q24;q11) t(1;7)(p32;q35) t(7;9)(p34;q32) t(7;11)(p35;p13) t(7;9)(q34;q34.3) t(;7)(q34;q34) t(7;19)(q34;p13) Doença Burkitt LNH-manto LNH-foliculares LLC-B LLA-pre B Burkitt LNH-célula grande Burkitt LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T & LNH LLA-T LLA-T Gene afectado C-Myc bcl-1 (CCND1/PRAD1) bcl-2 (apoptose) bcl-3 (ciclina?) IL-3 (citocina) bcl-6 (zinc-finger) Tal-1 TCL-3 (Hox11) Rhombotin 1 Rhombotin 2 (TCL-2) C-Myc Tal-2 dominio LIM TAN-1 lck LYL1

Linfoma de burkit

t(8;14) - t(8;22) - t(8;2)  Origina a expressão do c-myc nos linfócitos B

Linfomas foliculares e difusos

Diagrama mostrando os cromossomas 14 e 18 normais, e os cromossomas resultantes da translocação t(14;18)(q32;q21), envolvendo os genes BCL-2 (18q21) e IgH (14q32).

Translocação

t(15;17) (q22;q21) LMA-M3 t(11;17)(q35;q21) LMA-M3 t(5;17)(q35;q21)

Doença

t(9;22)(q34;q11) LMC;LLA adulto/LMA t(8;21)(q22;q22) LMA-M2 Inv(16)(p13;q22) LMA-M4Eo t(6;9)(p23;q34) LMA,LMA-TdT+ inv(3)(q21;q26) LMA-M1

Genes afectados

abl bcr a PML b RAR a d PLZF c RAR a d NPM e RAR a d ETO c AML1 MYH f CBFB g DEK CAN EVI1 c t(3;3)(q21;q26) t(1;9)(q23;q13) t(2;5)(p23;q35) LLA-pre B t(12;21)(p13;q22) LLA-prec.B infantis LNH-anaplásico t(4;11)(q21;q23) LLA-pre B t(1;11)(q32;q23) LAM t(6;11)(q27)(q23) LAM t(9;11)(p21;q23) LAM-M5,prec.B PBX1 h E2A TEL AML1 ALK a NPM e ALL c AF4 i AF1P e AF6 i AF9 i t(11;17)(q23;q21) LAM t(11;19)(q23;p13) LAM,LLA-prec. B AF19 ENL i t(8;13)(p11;q12) sindrome mieloproliferativo ZNF198 FGFR-1 a) tirosina cinase c) zinc finger e) fosfoproteina g) factor de transcrição i) transdução de sinal b) guanosina trifosfatase d) receptor acido retinoico f) gene da miosina h) gene homeótico

Genes hibridos resultantes de translocções

Bcr/abl

Os genes BCR e ABL normais, e as translocações que originam as proteínas p190 e p210 do gene quimera BCR-ABL. A proteína p210 é característica da CML, sendo a p190 a proteína BCR ABL encontrada na maioria dos casos de ALL

pml/rar

A localização cromossómica e estrutura normal dos genes PML e RARa, e a translocação t(15;17)(q22;21) que origina o gene quimera PML-RARA.