Transcript File - Cours L3 Bichat 2012-2013

Apoptose
Olivier Meilhac
Unité INSERM 698
CHU X. Bichat Paris 18e
[email protected]
01-40-25-86-11
1. Introduction
Apoptosis - (Gr. "falling") a process
seen in multicellular organisms, by which
specific cells are killed and removed for
the benefit of the organism.
Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. 1972. Br. J. Cancer 26:239.
Définition – rôle physiologique
 « mort cellulaire programmée »
 homéostasie : évite l’excès de cellules
 éliminer les cellules potentiellement dangereuses
 celles qui gênent le développement
 événements inducteurs :
 signaux de prolifération incompatibles avec l’état cellulaire
 signaux de mort :
- récepteur-médiés
- non récepteur médiés
 perte des signaux de survie (facteurs de croissance, contacts)
Déséquilibre  pathologie
prolifération
apoptose
apoptose
prolifération
• SIDA
• Maladies dégénératives
• Cancer
• anémie aplasique
• Maladies auto-immunes
• troubles ischémiques (infarctus du myocarde…)
• Infections virales
• maladies du foie induites par toxine (alcool…)
Apoptose vs nécrose
Mitochondrial Pathway
Death Receptor Pathway
FasL
oxidants ceramide others
Fas/Apo1
/CD95
D
DNA
damage
D
D
D
D
Bcl-2
FADD
DISC
Procaspase 8
dATP
Apaf -1
BID
Caspase 8
Procaspase 9
Procaspase 3
Cytochrome
c
dATP
Apaf -1
Caspase 9
Cellular targets
Caspase 3
apoptosome
Hengartner, M.O. 2000. Nature. 407:770.
Green, D. and Kroemer, G. 1998. Trends Cell Biol. 8:267.
2. Voie extrinsèque
• TNF-R1
TNF
• Fas
FasL
• DR3
Apo3L
• développement
• DR4
Apo2L/TRAIL
• apprentissage du système immunitaire
• DR5
Apo2L/TRAIL
• cellules tumorales
• CAR 1
?
Les récepteurs de mort
Elimination des cellules en excès ou dangereuses :
DD
DD
DD
TNF
FasL
TNFR1
Fas
DISC
DD
TRADD
FADD
DD
DD
DD
DD
DED
DD
DED
DED
DED
DED
Pro-caspase 8
caspase 8 active
DED
Les cellules tumorales contre-attaquent
2004, 4:321-6
Le lymphocyte T reconnaît un antigène tumoral (CMH)
Il augmente l’expression de FasL, mais la cellule tumorale est résistante
Lymphocyte T activé exprimant Fas, c’est lui qui meurt
FasL métastase : survie des cellules en milieu immunologique hostile ?
3.Voie intrinsèque
Elimination des cellules en réponse à une agression modérée :
• radiations ionisantes
• chimiothérapie
• dommages mitochondriaux : oxydants, calcium, céramide
Formation de l’apoptosome
Dec 2002. 14(6):715-20
activent floppase
inhibent translocase
Voie extrinsèque voie intrisèque
4. Famille Bcl-2
BH : Bcl-2 Homology
BH4 : anti-apoptotique
BH1-3 : pro-apoptotiques
BH3-only: pro-apoptotiques indirects
Activent les pro-apoptotiques
Inhibent les anti-apoptotiques
Ex :
Bad –Bik : inactivent Bcl-2 et BclXL
Bid- Bim : activent Bax et Bak
Curr Opin Cell Biol. 2003 Dec;15(6):691-9.
Caspase 8
BID
Truncated BID
p53 : pro-apoptotique ou arrêt du cycle cellulaire
Lésions de l’ADN
Déficit en facteurs
de croissance
c-myc
p53
transcription
+ Bax
+ Fas, DR5
+ PUMA/NOXA
+ APAF1
- Bcl-2…
apoptose
+ p21waf
+ cycline G
+ gadd45
+ mdm2
Arrêt du cycle
cellulaire
Si accumulation de cellules mutantes par perte de controle
apoptotique (ex: bcl-2 augmentée, mutation p53)  formation
de tumeur
5. Caspases effectrices ou exécutrices
• Pas de prodomaine Nter (dépourvu d’activité enzymatique)
• 3, 6, 7
• responsables des événements destructeurs
caspase cascade
Substrats des caspases
• 65 en 1998 :
 protéines de structure (cytoplasme et noyau)
 transduction de signal
 transcription / régulation
 contrôle du cycle cellulaire
 réplication / réparation de l’ADN
• plus de 280 en 2003
 spécifiques de certains types cellulaires
 conséquence du clivage souvent inconnu
 clivage parfois tardif,
(accessoire, conséquence de la cascade d’activation)
Cell Death and Differentiation, 2003; 10:76-100
Substrats en rapport avec les changements morphologiques
• ICAD : lève l’inhibition d’une DNAse  fragmentation de l’ADN
• ADN hélicase  condensation de la chromatine, remodelage nucléaire
• gelsoline  dépolymérisation de l’actine F
• kinases ROCK-1, PAK2  P° chaine légère de la myosine
« blebbing »
• filaments intermédiaires : cytokératine 18, vimentine
• organisation des filaments : gas-2, plectine
• « tenségrité » : liaison cellules-cellules, cellules -matrice extracellulaire
Fodrine, FAK, paxilline  inh° signaux de survie via intégrines
b-caténine, E-cadhérine, plakoglobine, desmogléine…
 Condensation cellulaire, rétraction, détachement
• protéines du RE, Golgi, vésicules de transport
• protéines nucléaires  lamina, pores (transport perturbé)
 réparation de l’ADN : PARP-1…
 protéines stabilisant la chromatine
 RNA hélicase A, facteurs de splicing  no transcription
 Facteurs d’initiation de traduction eIF2,3,4…
Substrats des caspases et signalisation
• protéines antiapoptotiques :  Bcl-2, BclX-L : antiproapoptotiques
 c-FLIP : inhibiteur de la caspase 8
 Bid c-Bid : libération de cytochrome c
 virus : leurres Bcl-2 like
• kinases :
 Akt et Raf-1 phosphorylent et inactivent Bad
 NFK-B : fragment de p65 lie l’ADN mais pas de transactivation
 IK-B : fragment n’est plus dégradé par le protéasome
 MEKK1 :fragment active d’autres caspases
6. Méthodes de détection de l’apoptose
Changements morphologiques
control
• Microscopie photonique :
- condensation de l’ADN, fragmentation
nucléaire, corps apoptotiques
• Microscopie électronique :
- balayage
- transmission
apoptotic
Fragmentation de l’ADN
Agarose gel
electrophoresis
Chromatin
Fragmented
Chromatin
Activation des caspases, changements mitochondriaux
 substrats chromogènes spécifiques
 anticorps spécifiques : western blot, immunodétection in situ
 western-blot cytochrome c : extraits cytosoliques / mitochondriaux
 cytométrie
Exposition des phosphatidyl-sérines
A- control
B-spontaneous apoptosis
C- actinomycin D
D- calcium ionophore
4
3
Propidium iodide
Quandrants
1
2
1 – viable cells
2 – early apoptosis; PS
exposed, intact membrane
3 – late apoptosis; PS exposed,
disrupted membrane
4 – necrosis; disrupted &
membrane loss
Annexin V-FITC
Abréviations :
TNF: Tumor Necrosis Factor
TRADD: TNF Receptor-Associated Death Domain
TRAF2 : TNF Receptor-Associated Factor 2
RIP: Receptor-Interacting Protein
SODD: Silencer Of Death Domains
FADD: Fas-Associated Death Domain
DISC: Death Inducing Signaling Complex
TRAIL: TNF Related Apoptosis Inducing Ligand
DR: Death Receptor
IAP : Inhibitor of Apoptosis Protein
FLICE : FADD Like Interleukin-1b Converting Enzyme (caspase 8)
cFLIP: FLICE Inhibitory Protein
APAF: Apoptosis Protease Activating Factor
BH: Bcl-2 Homology
Bcl-2: B Cell Lymphoma 2
7. Anoïkis : apoptose par détachement
Signaux de survie
Cellule 2
Collagène,
fibronectine,
vitronectine
Facteurs de
croissance
INTEGRINES
membrane
plasmique
a
RTK (ex: TrkB)
Cadhérines
b
Cellule 1
Protéines liant
l’actine
actine
ILK
Pinch, Nck2, IRS1?
FAK
b-caténine
Protéines
adaptatrices
PI3K
Cytosquelette
Akt
Signaux anti-apoptotiques :
• Inhibition de Bad, caspase 9
• Transcription d’IAP, bcl-2…
• Inhibition de la transcription de FasL, bim…
AKT
+
-
Caspase 9
Bad
FoxO
YAP
P
P
P
JNK/p38
iKB-kinase
CREB
mdm2
14.3.3 14.3.3 14.3.3
Bcl-2
E3 Ubiquitine-ligase
Dégradation d’IKB
séquestrés dans le cytosol
Dégradation de p53
Translocation de NFKB
NFKB
Transcription de
gènes pro-apoptotiques
FoxO
YAP
NOYAU
p73
FasL, bim…
Transcription de
gènes anti-apoptotiques
bcl-2, IAP…
8. Nouvelles formes d’apoptose
8.1 ETosis
Elastase
Elastase
DAPI
Histones
Histones
8.1 Eryptosis
Anévrisme
thrombus
F
Définitions
Anatomique : perte de parallélisme des bords de l’aorte réalisant une
masse battante et expansive
Physiopathologique : perte de la fonction de contention de l’artère
due à une protéolyse progressive de la matrice extracellulaire
F
Changements dégénératifs dans la média

Elastine
Collagène
 disparition des CML
Protéoglycanes
NT
T
NT
T
NT
T
NT
T
NT
media
adventice