Transcript e post-harvest - stayfresh
Strategie di difesa con agenti di biocontrollo in pre- e post-harvest …
… contro la «fumaggine» causata da Alternaria spp.
Moruzzi Serena, Martini Marta
Università degli Studi di Udine, DISA
Presentazione del problema 2000
: prime segnalazioni in FVG di alterazioni della buccia delle mele in campo e in ambiente di conservazione
Osservazione dei sintomi Presenza di fumaggine Indagini fitopatologiche (stereomicroscopio e isolamento) Presenza di agenti fungini
Presentazione del problema
2008:
Università di Udine, DISA
(p.a. Borselli S., prof. Osler R., dott. Grisan S., dott. Poggetti L.)
Agenzia Regionale per lo Sviluppo Rurale
(dott. Benvenuto L., dott. Malossini G., dott. Frausin C.)
FriulFruct
(dott. Zampa C.) hanno iniziato progetto di ricerca sulla malattia: 1. Ricerca bibliografica 2. Sintomatologia e diffusione della malattia: campo e ambiente di conservazione 3. Eziologia della malattia (identificazione agente/i patogeno/i): isolamento microrganismi e loro identificazione, postulati di Koch 4. Individuazione strategia di lotta/controllo: chimico biologico
1. Ricerca bibliografica
-
Problematiche simili (malattie epifitiche)
risultavano comuni nelle
zone temperate e umide
: diffuse in gran parte degli Stati Uniti, Europa (Olanda, Norvegia, Germania, Slovenia, Serbia, Polonia), Turchia, Giappone, Cina, Brasile - In
Italia
segnalazioni in Trentino Alto Adige, Piemonte, Emilia Romagna e Friuli Venezia Giulia (Lindner, 2009; Grosso et al., 2011)
Malattia Sooty blotch
(maculatura fuligginosa)
Agenti causali
- Gloeodes pomigena
(Schweinitz, 1832)
- Peltaster fructicola
(Johnson et al., 1997)
- Leptodontium elatius
(Johnson et al., 1997) - Geastrumia polystigmatis (Johnson et al., 1997) - 80 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui : Tripospermum spp. (Grabowski, 2007); Microcyclospora spp., Stomiopeltis spp., Microcyclosporella spp. (Gleason et al., 2011)
Classe Dothideomycetes, ordine Capnodiales (95%)
1. Ricerca bibliografica
Malattia Flyspeck
(macchiolina di mosca)
Agenti causali
- Schizothyrium pomi (Von Arx , 1959) - Zygophiala jamaicensis (Mason, 1945) - 10 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui: Ramularia spp., Dissoconium spp. (Gleason et al., 2011)
White haze
(patina bianca) - Tilletiopsis spp. (Boekhout et al., 2006)
2. Sintomatologia
Tipica delle
malattie epifitiche
(fumaggini) che si sviluppano a spese degli strati più superficiali e inerti del frutto:
Striature diffuse
sulla maggior parte della superficie del frutto, concentrate soprattutto (colore nero più intenso) nei dintorni della base del peduncolo e della depressione calicina; frequentemente sembrano descrivere il percorso di un
percolamento
, probabilmente in corrispondenza dei punti in cui si è trovata a scorrere acqua piovana o di condensa e quindi l’organismo si è sviluppato maggiormente in concomitanza di tali zone, più ricche d’acqua
2. Sintomatologia
Iniziale opacizzazione degli strati superficiali, che evolve in un
annerimento consistente
, causato dalla maturazione e sporulazione del micelio fungino
Odore organico
caratteristico Nessuna lesione o distruzione dei tessuti (
no rugginosità
) Interferenza sul normale sviluppo dei frutti (caratteristiche organolettiche) I sintomi si evidenziano soprattutto su Summerfree)
Golden Delicious
, ma risultano sintomatiche anche altre cultivar (Golden Lasa, Gold Rush, Brina,
2. Sintomatologia
In genere si riscontra in cella di conservazione : Durante la
conservazione in cella frigo
, sia in atmosfera controllata (ULO) che non, in condizioni di elevata umidità relativa, i sintomi si manifestano in maniera evidente Le mele sintomatiche nei bins sono disposte in
ordine sparso
e non come tipicamente avviene per le malattie da conservazione (infezione che inizia in campo) A volte (sulla base dell’andamento stagionale) è possibile riscontrare i
sintomi
iniziali
già in campo
, nel periodo estivo Mela sintomatica in campo Bins con mele sintomatiche Mela sintomatica in conservazione
2. Sintomatologia
Si è potuto osservare una
maggiore diffusione
della malattia: nelle annate con lunghi
periodi piovosi
in primavera, seguiti da estati calde in caso di presenza di
fitta copertura fogliare
sui frutti sviluppatisi nella
parte bassa
della pianta
DOVE COME QUANDO
2. Sintomatologia
CAMPO POCHI SINTOMI EVIDENTI CELLA FRIGO AUMENTO PROGRESSIVO SINTOMI SIA COME GRAVITÀ SIA COME INCIDENZA CELLA ATMOSFERA CONTROLLATA (ULO) AUMENTO PROGRESSIVO SINTOMI SIA COME GRAVITÀ SIA COME INCIDENZA DA LUGLIO ALLA RACCOLTA DALLA RACCOLTA FINO ALLA VENDITA DALLA RACCOLTA FINO ALLA VENDITA
2. Diffusione della malattia
Valutazione dei sintomi presenti su mele in campo e in cella di conservazione al fine di stabilire :
l’influenza della
tipologia di conservazione
(cella frigo o atmosfera controllata, ULO) sulla manifestazione dei sintomi l’influenza dei
trattamenti effettuati
sulla manifestazione dei sintomi l’influenza del
regime di coltivazione
(biologico o integrato) sulla manifestazione dei sintomi
Azienda 1 Azienda 2
2. Diffusione della malattia
Individuazione aziende e tesi sperimentali Regime Trattamenti
tesi trattata fino a termine consentito
Conservazione
Cella frigo Atmosfera controllata Integrato Cella frigo tesi non trattata a partire da ingrossamento frutti Atmosfera controllata tesi trattata in regime convenzionale da inizio ingrossamento frutti Cella frigo Biologico Atmosfera controllata Cella frigo tesi non trattata fino alla raccolta Atmosfera controllata Valutate e catalogate 2101 mele
2. Diffusione della malattia
% di superficie colpita dalla malattia in funzione della modalità di conservazione Azienda 1 Integrato Azienda 2 Integrato Azienda 2 Bio Atmosfera Controllata ( ULO) 16% 21% 37% Cella Frigo 20% 17% 33% Significatività n.s
n.s
Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version 3.00
n.s
L’ incidenza della malattia non è risultata correlata con la tipologia di conservazione
2. Diffusione della malattia
% di superficie colpita dalla malattia in funzione dei trattamenti e del regime di coltivazione Azienda 1 integrato Azienda 2 Integrato Azienda 2 Bio Trattato 14% 10% 31% Non Trattato 23% 30% 38% Significatività S
p <0,001
S
p <0,001
S
p <0,001 Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPad InStat version 3.00 -
L’ incidenza della malattia è risultata maggiore: nelle tesi non trattate rispetto a quelle trattate nelle tesi biologiche rispetto a quelle integrate
2. Diffusione della malattia
Conclusioni:
L’incidenza della malattia
non
è risultata
correlata di conservazione
(cella frigo o ULO) alla
tipologia
L’incidenza della malattia è risultata
inferiore nelle tesi trattate
, rispetto a quelle in cui i trattamenti sono stati sospesi in primavera o che non sono state sottoposte a trattamenti L’incidenza della malattia è risultata
superiore nelle tesi biologiche
, rispetto a quelle sottoposte a regime integrato
3. Eziologia
IDENTIFICAZIONE DEL MICRORGANISMO AL MICROSCOPIO OTTICO IDENTIFICAZIONE SINTOMI DELLA MALATTIA IN CAMPO OSSERVAZIONE DEI SINTOMI TIPICI E REISOLAMENTO DA MELE INOCULATE ARTIFICIALMENTE Applicazione dei POSTULATI DI KOCH ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE DELL ’ AGENTE PATOGENO INOCULO PATOGENO SU MELE SANE IN LABORATORIO
3. Eziologia
Isolamento da mele sintomatiche
da campo e da cella frigo , su
diversi substrati
(Potato Dextrose Agar, Potato Carrot Agar, Agar buccia di mela) e
diverse metodiche
(da porzione di buccia infetta, da raschiatura, da acqua di lavaggio di buccia infetta; incubazione a T ° ambiente o T ° controllata a 25 ° C) per isolare
tutta
la flora microbica presente Sviluppo di un
unico microrganismo ricorrente
3. Eziologia
Dictiospore di Alternaria al microscopio ottico Identificazione dell’agente causale al microscopio ottico
,
confermata da riconoscimento presso Istituto di Micologia Olandese (CBS):
gruppo Alternaria alternata
3. Eziologia
Verifica dei postulati di Koch: Inoculo artificiale
in laboratorio su mela
sana
(immersione intere mele in soluzione di spore di Alternaria 2*10 5 spore/ml , conservazione in cella frigo o a T ° ambiente fino a comparsa dei sintomi)
Reisolamento
su piastra da sintomatologia indotta
3. Eziologia
Conclusioni:
l’
agente causale
della malattia è risultato appartenere al genere
Alternaria spp
.
l’applicazione dei Postulati di Koch ha confermato
un solo microrganismo fungino
quale agente della malattia, sia in campo che nelle celle di conservazione
4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale
Capacità inibitoria dei principali fungicidi usati in melicoltura:
•Cyprodinil (Chorus) •Difenconazolo (Score) •Fluazinam (Ohayo) •Zolfo puro (Thiopron) •Pyraclostrobin (Bellis) •Boscalid (Cantus) •Dodina (Syllit) •Penconazolo (Topas) •Pyrimethanil (Scala) •Metiram (Polyram) •Iprodione (Rovral) •Captano (Make-up)
2 prove parallele:
Inibizione della crescita del micelio di Alternaria Inibizione della capacità germinativa delle spore di
Alternaria
4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale
Inibizione della crescita del micelio di Alternaria:
4 principi attivi sono risultati efficaci: - Difenconazolo (Score) - Iprodione (Rovral) - Penconazolo (Topas) - Cyprodinil (Chorus)
4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale
Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria
4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale
Agrofarmaco Riduzione germinazione spore di
Alternaria
Riduzione crescita micelio di
Alternaria
Pyrimethanil (Scala)
si
no
Metiram (Polyram) Captano (Make-up)
Penconazolo (Topas) Cyprodinil (Chorus) si si si si
no no
si si
Difenconazolo (Score) Iprodione (Rovral)
no no
si si
Principio attivo Inoculo patogeno
2% di spore di Alternaria germinate
Penconazolo
(Topas) Testimone
Inoculo patogeno
Testimone
Principio attivo Inoculo patogeno
Cyprodinil
(Chorus) 15% di spore di Alternaria germinate
Inoculo patogeno
Testimone Testimone
4. Strategia di controllo chimico: agricoltura biologica
Rame ossicloruro Colonia a 4 giorni di crescita su PCA
12 volte la dose consigliata in etichetta (40 gr/lt) 17 volte la dose consigliata in etichetta (60 gr/lt) 29 volte la dose consigliata in etichetta (100 gr/lt) 23 volte la dose consigliata in etichetta (80 gr/lt)
4. Strategia di controllo chimico: agricoltura convenzionale e biologica
Conclusioni:
Sono stati individuati alcuni
principi attivi
in grado di
controllare
la crescita del micelio e la germinazione delle spore di Alternaria spp., in particolare il
Penconazolo
e il
Cyprodinil
sono risultati i più efficaci Il
rame ossicloruro
, utilizzato nei regimi di
agricoltura biologica
, non dotato di selettività ed efficace nei confronti di gran parte degli organismi microfungini,
non si è dimostrato efficace
nei confronti di Alternaria spp.
Progetto Ager StayFresh
Inizio progetto: 2011
Il progetto di ricerca AGER STAYFRESH “Strategie innovative rispondenti ai bisogni delle imprese nel comparto degli ortofrutticoli della IV gamma”, si è occupato anche della ricerca di trattamenti fitoiatrici sostenibili, basati sull’utilizzo di antagonisti naturali contro i patogeni vegetali.
Attività previste (Task/activities):
1.2.4. Ricerca di antagonisti naturali contro malattie di post-raccolta su mela 1.2.5. Applicazione di antagonisti naturali e monitoraggio su mela (+) Caratterizzazione dell’agente causale della malattia
Caratterizzazione dell’agente causale
Valutazione della possibile variabilità genetica (caratterizzazione molecolare) del patogeno, a causa della
difficoltà del riconoscimento morfologico
delle specie di Alternaria «small spored» (Polizzotto et al., 2012):
Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche:
Estrazione del DNA da micelio fungino Amplificazione della
regione ITS
(Internal Transcribed Spacer) con tecniche di PCR-RFLP Confronto con i profili di restrizione dei ceppi di riferimento di A. alternata, A. arborescens e
A. tenuissima
Caratterizzazione dell’agente causale
Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche:
Amplificazione della
regione IGS
(Intergenic Spacer) con tecniche PCR-RFLP Confronto con i profili di restrizione dei ceppi di riferimento di A. alternata, A. arborescens e
A. tenuissima
Caratterizzazione dell’agente causale
Caratterizzazione morfologica su 41 ceppi di Alternaria spp. isolati da mele sintomatiche:
osservazione delle colonie su terreni Potato Carrot Agar e DRYES
A. arborescens A. alternata
Tot: 17 ceppi A. arborescens, 24 ceppi A. alternata
Caratterizzazione dell’agente causale
Ripetizione prova di patogenicità: inoculo patogeno su mela sana
mele sterilizzate
in esposizione a raggi UV-C lato, λ 254 nm) superficie con (UNIUD-DIAL, 10’ per individuati diverse
6 spot
posizioni per ciascuna mela, in 3 (calice, peduncolo, equatore) e spore
inoculati
(2*10 5 con una soluzione di spore/ml) di
Alternaria arborescens alternata
(3 ceppi diversi) e (3 ceppi diversi)
Alternaria
valutazione dello
ambiente
e a
0 ° C sviluppo dei sintomi
tipici della malattia (fumaggine nerastra) a
T
Caratterizzazione dell’agente causale
Spot sintomatici alla fine della prova (30 dpi a T ° amb, 80 dpi a 0 ° C)
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Mele infettate con A. arborescens 0°C Mele infettate con A. arborescens T° amb Mele infettate con A. alternata 0°C Mele infettate con A. alternata T° amb
Spot sintomatico, a occhio nudo e allo stereomicroscopio
Caratterizzazione dell’agente causale
Conclusioni:
Sono stati isolati
diversi ceppi fungini
associati alla sintomatologia descritta e appartenenti al gruppo di Alternaria alternata In particolare, sono stati identificati
24 17
ceppi di ceppi di
A. alternata A. arborescens
e Le prove di patogenicità effettuate hanno permesso di stabilire che
A. arborescens
è in grado di provocare sintomi identici a quelli osservati in campo
A. alternata
invece ha manifestato una minor virulenza, con sintomi più lievi e assenza del caratteristico odore organico La
valutazione
dei
sintomi
ad occhio nudo è risultata spesso
difficoltosa
(necessità di uso dello stereomicroscopio)
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Ricerca degli antagonisti: 90 isolamenti
da mele asintomatiche in cella frigo
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
73 isolati
tra lieviti e funghi utilizzati per
prove di antagonismo
preliminari in vitro contro Alternaria spp.
Alternaria
ORGANISMI EFFICACI antagonista ORGANISMI NON EFFICACI
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
57 microrganismi
sono risultati in grado di
ostacolare la crescita
del patogeno
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Identificazione degli antagonisti:
Suddivisione morfologica Estrazione rapida del DNA genomico fungino PCR-RFLP Sequenziamento e confronto in GenBank
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Identificazione degli antagonisti:
30 25 20 15 10 5 0
Aureobasidium Cryptosporiopsis Epicoccum Acremonium
Funghi diversi Lieviti diversi
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Azione degli antagonisti: Prove di antagonismo in vitro a T° ambiente
per : Aureobasidium
Cryptosporiopsis Acremonium Alternaria
(controllo)
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti (temperatura ambiente)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Aureobasidium Acremonium Cryptosporiopsis Alternaria (controllo)
7 giorni 14 giorni 21 giorni 28 giorni
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Azione degli antagonisti: Prove di antagonismo in vitro in cella frigorifera (≈ 0°C)
per : Aureobasidium Cryptosporiopsis Acremonium
Alternaria
(controllo)
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Crescita della colonia di Alternaria (in mm) in presenza degli antagonisti (0 ° C)
25
Aureobasidium
20
Acremonium
15 10
Cryptosporiopsis
5 0
Alternaria (controllo)
4 sett 5 sett 6 sett 7 sett 8 sett 9 sett
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Analisi molecolari su 27 ceppi isolati di Aureobasidium spp.:
Analisi della porzione ITS Analisi con tecniche di rep-PCR nessuna differenza evidenziabile suddivisione in circa 10 gruppi molecolari Le sequenze ottenute dalla porzione ITS di 2 ceppi rappresentativi hanno mostrato una similarità di sequenza del 100% con la sequenza di A. pullulans var. pullulans strain CBS 584.75 (accession number FJ150906) presenti in banca dati
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Verifica dell’azione antagonistica in vitro
di ciascun gruppo nei confronti di diversi ceppi di Alternaria spp. (3 A. arborescens + 3 A. alternata) B B B B A A A A Azione antagonista di A. pullulans (A) nei confronti di A. arborescens (B) Azione antagonista di A. pullulans (A) nei confronti di A. alternata (B) A. pullulans è risultato svolgere una valida azione antagonista nei confronti di A. arborescens, mentre non è risultato molto efficace nei confronti di A. alternata
Scelta di 4 ceppi rappresentativi di A. pullulans
da usare nelle prove di antagonismo in vivo su mele frigoconservate: 1-4-6-10
Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti
Conclusioni:
Sono stati isolati
diversi organismi con azione antagonistica
nei confronti di Alternaria spp.
Gli organismi rivelatisi maggiormente efficaci (appartenenti a 3 diversi generi) sono stati utilizzati
per prove di antagonismo a temperatura ambiente
e a circa
0 ° C
(t delle celle di conservazione) e hanno mostrato di ostacolare in maniera significativa la crescita del patogeno in condizioni di temperatura
entrambe
le Gli organismi isolati appartenevano
principalmente
(27 su 57) alla specie
Aureobasidium pullulans
, appartenenti a 10 gruppi molecolari L’azione antagonistica è risultata
più efficace
nei confronti di che nei confronti di A. alternata
A. arborescens
4 ceppi
di
A. pullulans
più efficaci in vitro sono stati
scelti per prove in vivo
Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti
in pre-harvest
Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens:
individuazione a Maggio
di un
meleto
da condurre
senza trattamenti fungicidi
preparazione di una
soluzione
di cellule di
Aureobasidium pullulans
6-10 ad una concentrazione finale di 2* 10 8 CFU/ml ceppi 1-4-
10 piante
trattate ciascuna con 500 ml della soluzione ottenuta, distribuita con atomizzatore sull’intera chioma
4 trattamenti
durante la stagione : 28.06.13; 27.08.13; 03.09.13; 16.09.13
raccolta mele
da 10 piante trattate (circa 1000 frutti) e da 10 non trattate (circa 800 frutti) (controllo negativo) il 26.09.13
individuati
6 spot
per ciascuna mela in 3 diverse posizioni con le stesse modalità utilizzate per la prova di patogenicità,
inoculati
con una soluzione di spore di
Alternaria arborescens
(2*10 5 spore/ml) valutazione dello
sviluppo dei sintomi
in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in
bassa umidità relativa
a
T ° ambiente
tipici della malattia (fumaggine nerastra) e a
0 ° C ambiente con
Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti
in post-harvest
Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens
:
mele
di non trattate
inoculate
Aureobasidium pullulans
per immersione in una soluzione di cellule (5*10 8 cfu/ml) individuati
6 spot
per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni e con le stesse modalità utilizzate per la prova di patogenicità, e
inoculati
con una soluzione di spore di
Alternaria arborescens
(2*10 5 spore/ml) valutazione dello
sviluppo dei sintomi
tipici della malattia (fumaggine nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in
ambiente con elevata umidità relativa
a
T ° ambiente
e a
0 ° C
Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest
Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens a T ° ambiente
Mele non trattate con elevata u.r.
A A Mele trattate in post-harvest B Mele non trattate con bassa u.r.
Mele trattate in pre-harvest B Comparsa dei primi sintomi (15 dpi) Fine prova (40 dpi) Fisher’s exact test: P < 0.0001, estremamente significativo
Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest
Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens in cella frigorifera
A A Mele non trattate con elevata u.r.
Mele trattate in post harvest Mele non trattate con bassa u.r.
Mele trattate in pre harvest B B Comparsa dei primi sintomi (120 dpi) Fine prova (200 dpi) Fisher’s exact test: P < 0.0001, estremamente significativo
Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest
Conclusioni:
Sono stati effettuati
trattamenti
per verificare la capacità dell’antagonista di contenere la malattia,
in pre-raccolta
, con buoni risultati ma con alcune criticità: si sono manifestati
leggeri sintomi a carico delle foglie
(piccole necrosi fogliari), dovuti probabilmente alla eccessiva quantità di cellule di A. pullulans utilizzate ed alla modalità di trattamento si sono osservati dei
sintomi di fumaggine
(provocata da A. pullulans e diversa da quella causata da A. arborescens) durante la conservazione, nelle porzioni maggiormente umide Sarà necessario
mettere a punto i trattamenti
, con una minore quantità di spore per ottimizzare l’azione dell’antagonista, e trovando il momento ideale per l’applicazione
Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest
Conclusioni:
Sono stati effettuati
trattamenti
per verificare la capacità dell’antagonista di contenere la malattia quando utilizzato
in post raccolta
, con ottimi risultati
Aureobasidium pullulans
si è dimostrato un
organismo di biocontrollo efficace
anche nei confronti della fumaggine del melo