А.С. Спирин

Молекулярная биология:

Лекция 2.

Мир РНК

19 февраля 2014 г.

Функции РНК

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ РНК ДНК РНК

Белки

Кодирующая функция:

программирование белкового синтеза

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ РНК

(1) Показано, что РНК (как и ДНК!) могут служить матрицей для собственного воспроизведения через комплементарные цепи РНК: 1962-1964 – открытие самовоспроизведения полиовирусной РНК в животных клетках (D. Baltimore).

1965-1966 – открытие самовоспроизведение РНК бактериофагов типа R17 и MS2 в бактериальных клетках (S. Spiegelman).

(2) Показано, что РНК могут служить матрицей для синтеза ДНК: 1970 – открытие обратной транскрипции (H.M. Temin, D. Baltimore).

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ РНК ДНК Репликативная функция:

копирование генов, обратная транскрипция, саморепликация

РНК

Белки

Кодирующая функция:

программирование белкового синтеза

БИОПОЛИМЕРЫ

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ: Линейная последовательность мономеров в цепи   кодирование,  репликация.

ПОЛИПЕПТИДЫ (БЕЛКИ): Свернутая структура  трехмерный рисунок поверхности   трехмерное узнавание лигандов,  катализ.

КОМПАКТНОЕ СВОРАЧИВАНИЕ ВЫСОКОПОЛИМЕРНОЙ РНК

A. S. Spirin (1960) On macromolecular structure of native high-polymer ribonucleic acid in solution. J. Mol. Biol. 2: 436-446.

КОМПАКТНОЕ СВОРАЧИВАНИЕ ЦЕПИ тРНК В СПЕЦИФИЧЕСКУЮ ТРЕТИЧНУЮ СТРУКТУРУ

Atomic model of yeast phenylalanine tRNA J.D. Robertus, J.E. Ladner, J.T. Finch, D. Rhodes, R.S. Brown, B.F.C. Clark and A. Klug (1974) Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Å resolution. Nature 250: 546-551.

S.H. Kim, F.L. Suddath, G.J. Quigley, A. McPherson, J.L. Sussman, A.H.-J. Wang, N.C. Seeman and A. Rich (1974) Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA. Science 185: 435-440.

ТРЕТИЧНЫЕ СТРУКТУРЫ ДВУХ РИБОСОМНЫХ РНК В СОСТАВЕ РИБОСОМЫ

16S ribosomal RNA 23S ribosomal RNA M.M. Yusupov, G.Zh. Yusupova, A. Baucom, K. Lieberman, T.N. Earnest, J.H.D. Cate, H.F. Noller (2001) Science 292: 883-896

КАТАЛИТИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ РНК (РИБОЗИМЫ) (1) Открытие природных рибозимов:

K. Kruger, P.J. Grabowski, A.J. Zaug, J. Sands, D.E. Gottschling and T.R. Cech (1982) Self-splicing RNA: Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequences of Tetrahymena. Cell 31: 147-157.

C. Guerrier-Takada, K. Gardiner, T. Marsh, N. Pace and S. Altman (1983) The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35: 849-857.

(2) Создание искусственных рибозимов:

D.L. Robertson and G.F. Joyce (1990) Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature 344: 467-468.

Reviewed in: T.R. Cech and B.L. Golden (1999) Building a catalytic active site using only RNA. In

The RNA World,

2 nd Edition (Eds. R.F. Gesteland et al.), CSHL Press, New York.

Разнообразие активностей природных и искусственных рибозимов:

• • • • • • • Гидролиз фосфоэфирных связей Трансэстерификация Лигирование и полимеризация нуклеотидов, в том числе на матрице ДНК или РНК Алкилирование и аминоацилирование нуклеотидов Синтез амидных (пептидных) связей между аминокислотами Транспептидация Синтез углерод-углеродных связей

ФУНКЦИЯ УЗНАВАНИЯ МАЛЫХ ЛИГАНДОВ (СУБСТРАТОВ)

(1)

E. Cundliffe (1986)

Involvement of specific portions of ribosomal RNA in defined ribosomal functions: A study utilizing antibiotics. In

Structure, Function, and Genetics of Ribosomes

(Eds. B. Hardesty and G. Kramer), p.p. 128-142. Springer-Verlag, New York.

«До сих пор не подозреваемая способность РНК узнавать малые молекулы»

.

(2)

Открытие и создание аптамеров. Методология SELEX’a.

А. Ellington and

J. Szostak (1990)

In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.

Nature

346:

818-822.

C. Tuerk and

L. Gold (1990)

Systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Science 249: 505 510.

(3)

Демонстрация специфических взаимодействий природных РНК с малыми молекулами.

D. Fourmy, M.I. Recht, S.C. Blanchard and

J.D. Puglisi (1996)

Structure of the A site of

E. coli

16S rRNA complexed with an aminoglycoside antibiotic. Science 274: 1367-1371.

Трехмерные структуры комплексов РНК с аминогликозидными антибиотиками.

(a) Paromomycin-A-site RNA complex. (b) Tobramycin-RNA aptamers complex.

Reproduced from J.D. Puglisi and J.R. Williamson (1999) In

The RNA World,

2 nd Edition (Eds. R.F. Gesteland et al.), CSHL Press, New York.

МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ РНК (1) Кодирующая функция:

программирование белкового синтеза линейными последовательностями полирибонуклеотидов.

(2) Репликативная функция:

репликация генетического материала через комплементарные последовательности полинуклеотидов.

(3) Структурообразующая функция (формирование трехмерных структур):

само-сворачивание линейных полирибонуклеотидов в уникальные компактные конформации.

(4) Функция специфического узнавания лигандов:

специфические пространственные взаимодействия с другими макромолекулами и малыми лигандами.

(5) Каталитическая функция:

специфический катализ химических реакций рибозимами.

Таким образом,

рибонуклеиновые кислоты

способны осуществлять

все основные функции, свойственные как ДНК, так и белкам

.

Следовательно, ансамбли молекул РНК с разными взаимодополняющими функциями могут быть самодостаточными в качестве ассимилирующих, метаболизирующих, структурообразующих и реплицирующихся систем, т. е. быть прототипами живых систем.

Таким образом,

рибонуклеиновые кислоты

способны осуществлять

все основные функции, свойственные как ДНК, так и белкам

.

Следовательно, ансамбли молекул РНК с разными взаимодополняющими функциями могут быть самодостаточными в качестве ассимилирующих, метаболизирующих, структурообразующих и реплицирующихся систем, т. е. быть прототипами живых систем.

МИР РНК : САМОДОСТАТОЧНОСТЬ!

ОДНОПОЛИМЕРНЫЙ ЖИВОЙ МИР – ДРЕВНИЙ МИР РНК?

ПРОИСХОЖДЕНИЕ СОВРЕМЕННОЙ ЖИЗНИ НА ОСНОВЕ ДРЕВНЕГО МИРА РНК?

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ЖИЗНИ

« В теплом маленьком пруду , содержащем наборы аммонийных и фосфорных солей, при наличии света, тепла, электричества , и т.п., можно представить себе химическое образование белкового компонента , который бы далее подвергался еще большему усложнению…; в наши дни такой материал был бы немедленно съеден или поглощен, чего не случилось бы, пока не образовались живые существа».

Ч. Дарвин, 1871

DARWIN POND:

“a small lake or pond with soluble compounds accumulating from a surrounding drainage area”.

S.J. Mojzsis, R. Krishnamurthy and G. Arrhenius (1999) Before RNA and after: Geophysical and geochemical constraints on molecular evolution. In:

The RNA World,

2 nd Edition (Eds. R.F. Gesteland et al.), p.p. 1-47. CSHL Press, New York .

«ДАРВИНОВСКИЙ ПРУД»:

Небольшое озерко или прудик с растворимыми компонентами из окружающей дренажной области.

Происхождение жизни по А.И. Опарину (1924)

АБИОГЕННЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ ПОЛИПЕПТИДЫ, транспептидация БЕЛКИ с уникальными трехмерными структурами Образование надмолекулярных структур, разделение фаз Каталитические активности, ФЕРМЕНТЫ Каталитически активные КОАЦЕРВАТЫ Ассимиляция, рост, размножение КЛЕТКИ

АБИОГЕННЫЙ СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ

S.L. Miller (1953) A production of amino acids under possible primitive Earth conditions. Science 117, 528-529.

H

2

+ CH

4

+ NH

3

+ H

2

O H

2

N-CHR-COOH H

2

N-CHR-CONH

2

H

2

N-CHR'-CONH

2

+ H

2

N-CHR''-COOH = = H

2

N-CHR'-CO-NH-CHR''-COOH + NH

3

Происхождение жизни из древнего мира РНК

Gilbert, W. (1986). Origin of life: The RNA world. Nature 319, 618.

АБИОГЕННЫЕ РИБОНУКЛЕОТИДЫ ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДЫ, трансэстерификация ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДЫ Каталитические активности (рибозимы) Самопроцессирующиеся и самореплицирующиеся молекулы РНК Синтез белка КОАЦЕРВАТЫ КЛЕТКИ

Древний мир РНК

• Возникновение и существование мира РНК на Земле требовало

жидкой водной среды

с нейтральной рН и растворенными солями одновалентных металлов (в первую очередь

K

+ и Na + ) и

Mg

2+

.

• Скорее всего, мир РНК мог возникнуть и существовать в

мелких водоемах

(лужах, «дарвиновских прудах»), где могли

концентрироваться абиогенно возникающие органические вещества

для этого). (океанские просторы едва ли годились • Появление и присутствие

РНК-репликазной активности

в водной среде РНК-содержащей лужи или пруда должно было давать в результате эффект

амплификации всех олиго- и полирибонуклеотидов этого водоема

, т.е. рост общей популяции молекул РНК.

Ancient RNA world as precursor of life on the Earth

DNA RNA RNA Proteins Proteins RNA

(1) (3) (4) (5)

“Spontaneous rearrangements in RNA sequences”

H.V. Chetverina, A.A. Demidenko, V.I. Ugarov and A.B. Chetverin

FEBS Letters

450: 89-94 (1999) Цепи РНК в растворе при температурах от 5° до 37°C время от времени обмениваются частями своих последовательностей; обмен может осуществляться как между разными молекулами (

транс-перестройки

), так и внутри одной и той же молекулы (

цис-перестройки

).

(2) Эти перестройки

не специфичны

могут происходить в любом месте цепей.

по отношению к последовательности и В отличие от рибозимных и ферментативных реакций,

3´-гидроксилы не участвуют

реакции, а части РНК реагируют друг с другом внутренними районами.

в спонтанной Реакция зависима от

присутствия Mg2+.

Скорость спонтанных перестроек –

одно событие в час на миллиард нуклеотидов

; это означает, что 0.002% – 0.02% цепей РНК с длиной 800 – 8000 нуклеотидных остатков спонтанно перестраиваются в популяции РНК в течение 24 часов.

Итак, реакция не требует никаких других компонентов, кроме самой РНК и Mg2+, и, таким образом, может рассматриваться как присущее РНК химическое свойство и должна происходить повсюду в живой и неживой природе.

Мир РНК: Зарождение и эволюция в первобытном пруду или луже?

Достаточная

длина полирибонуклеотидов

и непрерывная

генерация вариантов

Мир РНК: Зарождение и эволюция в первобытном пруду или луже?

Достаточная

длина полирибонуклеотидов

и непрерывная

генерация вариантов

– Появление полирибонуклеотидов-рибозимов с различными каталитическими активностями, включая:  рибозимы, катализирующие реакции

синтеза предшественников

самих нуклеотидов (нуклеозидтрифосфатов), и нуклеотидов и  рибозимы, катализирующие полирибонуклеотидов

комплементарную репликацию

(РНК-полимеризующие рибозимы).

Мир РНК: Зарождение и эволюция в первобытном пруду или луже?

Достаточная

длина полирибонуклеотидов

и непрерывная

генерация вариантов

– Появление полирибонуклеотидов-рибозимов с различными каталитическими активностями, включая:  рибозимы, катализирующие реакции

синтеза предшественников

самих нуклеотидов (нуклеозидтрифосфатов), и нуклеотидов и  рибозимы, катализирующие полирибонуклеотидов

комплементарную репликацию

(РНК-полимеризующие рибозимы).

Реплицирующаяся («размножающаяся») популяция разнообразных и разнообразящихся полирибонуклеотидов – «

прудовая коммуна РНК

».

Мир РНК: Зарождение и эволюция в первобытном пруду или луже?

Проблемы:

   Прудовая коммуна полирибонуклеотидов! («РНК-Солярис»).

«От каждого – по способностям, каждому – по потребностям»!

Идентификация функционально лучших? Удержание «гена» и «признака»  рибозима и его продукта  вместе? Отсев «негодных»? отбор нужных и лучших? дальнейшая эволюция?

КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ КАК НЕОБХОДИМОЕ УСЛОВИЕ ЕСТЕСТВЕННОГО ОТБОРА И ЭВОЛЮЦИИ

Чтобы естественный компартментализации отбор начал обособления работать, отдельных необходима ансамблей какая-то РНК, в форма которых

рибозимы и их продукты удерживались бы вместе

дополняют друг друга.

. Только тогда естественный отбор мог отличить те РНК, чей продукт лучше, и те ансамбли, чьи РНК функционально лучше Лучшие обособленные ансамбли РНК – первозданные

особи

– должны расти быстрее других, перерастать других, тем самым обеспечивая отбор лучших.

ОБОСОБЛЕНИЕ (КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ): Структурная агрегация?

Коацервация?

Мембранная оболочка!?

RNA COLONIES ON A GEL SURFACE: replicable RNA molecules (RQ RNAs) are air-borne

Petri dish was closed Petri dish was open for 1 hour 1 hour incubation at 25º C with replicase

A.B. Chetverin, H.V. Chetverina and A.V. Munishkin (1991) On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qβ replicase. J. Mol. Biol. 222 , 3-9.

Мир РНК: Смешанные колонии на твердых средах

Если

различные молекулы РНК

подсыхания лужи, то, при и

РНК-реплицирующий рибозим

оказываются в одном месте на влажной твердой поверхности в результате наличии необходимых органических и энергетических субстратов для их синтеза на поверхности или вокруг, они могут начать амплифицироваться и формировать

смешанные колонии РНК

.

Мир РНК: Смешанные колонии на твердых средах

Такая смешанная колония-ансамбль должна включать молекулы РНК, обладающие различными, необходимыми друг для друга активностями, а именно:  Лиганд-связывающие молекулы РНК для избирательной адсорбции необходимых веществ из окружающей среды и их накопления (концентрирования) в колонии.

 Набор рибозимов, катализирующих метаболические реакции для синтеза предшественников нуклеотидов и самих нуклеотидов (нуклеозидтрифосфатов).  Рибозим, катализирующий комплементарную репликацию всех РНК колонии (РНК-полимеризующий рибозим).

КОЛОНИИ РНК КАК ПЕРВИЧНЫЕ ОСОБИ Смешанные колонии РНК

на твердых или полутвердых поверхностях и могли быть первыми РНК.

эволюционирующими бесклеточными ансамблями

, где одни молекулы выполняли генетические функции (репликацию молекул РНК всего ансамбля), а другие формировали структуры, необходимые для успешного существования (например, такие, которые адсорбировали нужные вещества из окружающей среды) или были рибозимами, ответственными за синтез и подготовку субстратов для синтеза Такая бесклеточная ситуация создавала условия для

очень быстрой эволюции

своими молекулами – своим генетическим материалом. : колонии РНК не были отгорожены от внешней среды и могли легко обмениваться

СЦЕНАРИЙ ПЕРВОБЫТНОГО SELEX’a

(1) Когда функционально различные молекулы РНК, включая РНК-реплицирующий рибозим, оказываются в одной луже, и разнообразие молекул.

вся популяция РНК количественно увеличивается

, а благодаря реакциям спонтанной трансэстерификации (реакция Четверина) и ошибкам репликации увеличивается (2)

Когда лужа подсыхает

реакций, , молекулы РНК оказываются на влажной поверхности глины или другого минерального субстрата, и при наличии в данном месте молекулы РНК-реплицирующего рибозима и нескольких других молекул РНК, обеспечивающих связывание нужных веществ и катализ нужных

быстрее образуется и растет смешанная колония РНК

других.

; наиболее

успешные колонии (т.е. колонии с наиболее активными и лучше всего дополняющими друг друга молекулами РНК) растут

(3) Последующее

затопление

опять начинается подсушенного водоема или его части растворяет колонии, и в общем водоеме

общая амплификация, но уже в популяции, обогащенной «хорошими

», т.е.

активными и функционально дополняющими друг друга молекулами.

Таким путем

чередующиеся затопления и подсушивания

систематическое обогащение популяции РНК РНК-содержащих водоемов (луж) обеспечивают функционально (

«

систематическая эволюция путем экспоненциального обогащения

»

)

.

лучшими молекулами

BIRTH AND EVOLUTION OF RNA WORLD:

ABIOGENOUS RIBONUCLEOTIDES



OLIGORIBONUCLEOTIDES, TRANSESTERIFICATION



POLYRIBONUCLEOTIDES, RECOMBINATIONS



LIGAND RECOGNITIONS, CATALYTIC ACTIVITIES RNA WORLD :

Evolution by cycles of replication selection “UNIVERSAL ANCESTOR” ORIGIN OF MODERN LIFE

CATALYTIC REPLICATION OF RNAs: COMMUNAL RNA POOL IN A “DARWINIAN PUDDLE”

DRYING OUT

SELECTION OF APT RNAs: GROWTH OF MIXED RNA COLONIES ON MOIST SOLID SURFACE

FLOODING

RIBOCYTES

ORIGIN OF PROTEIN SYNTHESIS, UNIVERSAL GENETIC CODE; ORIGIN OF DNA

PROGENOTES



CELLS, ORGANISMS

КОНЕЦ ЛЕКЦИИ

Две ипостаси древнего мира РНК

Именно таким путем чередования стадий размножения и селекции мог развиваться и эволюционировать древний мир РНК.

Две ипостаси

этого мира РНК сосуществовали и переходили друг в друга:

коммунальные

индивидуальных молекул РНК, растворенных в водной среде луж, где реализовался принцип «от каждого по способностям, каждому по потребностям», и

сообщества

размножающихся и разнообразящихся

конкурирующие особи

в виде смешанных колоний РНК, временно существующих и растущих на влажных поверхностях.

ВЫСОКАЯ СКОРОСТЬ ЭВОЛЮЦИИ ДРЕВНЕГО МИРА РНК

Эволюционный процесс должен был быть исключительно быстрым благодаря трем обстоятельствам.

(1) Непрерывные

спонтанные рекомбинации

низкая точность примитивных механизмов репликации, обеспечивали широчайшее

поле вариантов

для отбора.

и перестройки молекул РНК, а также (2) (3) Свободный

латеральный перенос

и обмен молекулами РНК между колониями через воду и атмосферу делал существования.

любые полезные инновации достоянием всех

и позволял колониям быстро совершенствоваться в течение короткого времени их

Экспоненциальное обогащение

всей популяции «лучшими» молекулами РНК в

циклах амплификации-селекции

всего

коммунального мира РНК

создавало мощный эволюционный двигатель для в целом.

Колонии РНК как универсальный коммунальный предшественник мира живых существ

Отсутствие клеточной стенки (внешней мембраны).

Отсутствие трансляции (синтеза белков).

Поле вариантов РНК благодаря спонтанным перестройкам.

Латеральный перенос молекул РНК – Быстрое распространение любых инноваций; Очень высокий темп эволюции.

Коммунальное сообщество, эволюционирующее как целое.

Именно это сообщество, а не отдельная колония или возникшая из нее клетка, было универсальным предшественником, из которого выросли разные филогенетические ветви клеточных организмов, с универсальным генетическим кодом .

(Ср. с «прогенотами» C. Woese (1998) The Universal Ancestor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6854-6859.)

ОТ КОЛОНИЙ РНК К РИБОЦИТАМ

Колонии РНК, которые приобрели свойство синтезировать или адсорбировать на себе какие-то гидрофобные вещества, покрывающие их снаружи и удерживающие весь ансамбль вместе в водной среде даже во взвешенном, оторванном от поверхности состоянии, получали колоссальные преимущества, сохраняя свои эффективные функциональные наборы молекул после затоплений. Это уже был прообраз клеточной организации.Такие

ограниченные оболочкой ансамбли молекул РНК

, обладающих разными адсорбирующими и каталитическими функциями, были названы

рибоцитами

(M. Yarus).

В первичных рибоцитах

отсутствовала ДНК и белки

– это были так называемые «одно полимерные системы» (single-polymer systems). Благодаря многообразию функций РНК и самодостаточности РНК как омнипотентного полимера, рибоциты могли жить,

размножаться, конкурировать друг с другом и эволюционировать

.

«ИЗОБРЕТЕНИЕ» БЕЛКОВОГО СИНТЕЗА В РИБОЦИТАХ: ВОЗНИКНОВЕНИЕ РИБОСОМЫ

Решающим моментом в эволюции рибоцитов было

возникновение аппарата синтеза белка

. Белки гораздо эффективнее РНК и как структуро-образующие полимеры, и как катализаторы. «Изобретение» аппарата белкового синтеза (трансляции) на основе РНК значительно

усовершенствовало структуру и метаболизм рибоцитов

и, тем самым, дало им громадный эволюционный импульс.

Аппарат белкового синтеза строится на основе

универсальной белок-синтезирующей машиной рибосомы

во всем , которая является живом универсальность доказывает, что вся современная жизнь началась с рибосомы

.

мире.

Ее Рибосома могла возникнуть путем

объединения предсуществовавших разнофункциональных коротких РНК

функциональное качество.

, когда-то оказавшихся в одном месте, в одной колонии или рибоците, и вместе давших этой колонии или рибоциту новое Имеются все

только из РНК

.

основания предполагать, что первобытная рибосома состояла Вполне вероятно, что рибоцит мог обходиться всего поначалу немногочисленных, белков.

одной рибосомой

для синтеза своих,