Transcript prezentacija

Fototermalna antitumorska aktivnost
grafenskih nanočestica i
ugljeničnih nanotuba pobuđenih
zračenjem bliske IC oblasti
S. Misirlić Denčić, Z. Marković, B. TodorovićMarković, D. Kepić, K. Arsikin, Ž. Stanojević, N.
Zogović, M. Dramićanin, V. Trajković
Uvod


U okolnostima nemogućnosti primene hirurške
terapije, selektivna ablacija malignog tkiva
toplotom je efikasna alternativna terapijska
metoda.
Nažalost, glavne termičke ablativne tehnike (laser,
ultrazvuk, mikro-talasi i radio-talasi) ne poseduju
same po sebi selektivnost prema malignim ćelijama.
Uvod


U skladu sa tim, neophodno je povećati osetljivost
malignih ćelija na iradijaciju u cilju povećanja
efikasnosti i smanjenja toksičnosti pri primeni
termalne ablacije tumorskog tkiva.
Jedna od mogućih, obećavajućih strategija
fototermalne terapije maligniteta je upotreba
nanočestica u cilju efikasne konverzije energije
zračenja bliske IC oblasti u vibracionu energiju i
sledstvenu toplotu koja ubija maligne ćelije.
Uvod

Upotreba zračenja bliske IC oblasti u opsegu 7001000 nm za indukciju hipertermije je posebno
interesantna, obzirom da biološki sistemi
uglavnom nemaju hromofore koje mogu
apsorbovati zračenja ovih talasnih dužina.
Uvod


Ugljenične nanotube (CNT) su cilindrične strukture
do nekoliko stotina nanometara u dijametru, dužine
nekoliko mikrometara, koje se sastoje od atomskitankih listića ugljenika koji su zovu grafen.
Poslednjih par godina proučavanje osobenosti
grafena ukazuje na svojstva koja prete da ugroze
dominaciju CNT u nanotehnologijama, i otvaraju
mogućnost primene grafena u biomedicini.
Uvod


Ipak, za razliku od potvrđenog fototermalnog
antitumorskog delovanja CNT, efekti grafenskih
nanočestica na ćelije tumora do danas nisu
razjašnjeni.
Samo jedna skorašnja studija (Nano Lett
2010;10:3318) na mišjem modelu je pokazala da
intravenski aplikovane grafenske nanočestice
smanjuju veličinu tumora nakon hipertermije
izazvane zračenjem bliske IC oblasti.
Uvod

Ipak, dva vrlo važna pitanja ostala su do danas
bez odgovora:
1. Koji molekularni mehanizmi stoje u osnovi
grafenom-posredovanog fototermalnog antitumorskog
dejstva?
2. Kakva je fotermalna efikasnost grafena u poređenju
sa CNT?
Cilj istraživanja

U ovom istraživanju poređeno je fototermalno
antitumorsko dejstvo grafenskih nanočestica i
ugljeničnih nanotuba pobuđenih kontinualnim IC
laserom talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model
„RLTMDL-808-1 W“proizvođača „Roithner
LaserTechnik“), u trajanju od 30-300s.
Materijal i metode

1.
2.
3.
U eksperimentima su korišćene stabilne vodene
suspenzije sledećih nanočestica:
Polivinil-pirolidin grafenskih nanočestica (GPVP)
Ugljeničnih nanotuba funkcionalizovanih sa DNK(CNTDNA)
Ugljeničnih nanotuba funkcionalizovanih sa
natrijum dodecilbenzensulfonatom (CNTSDBS)
Materijal i metode


“Atomic force microscopy” (AFM) merenja su
izvršena na AFM mikroskopu (Quesant Instrument
Corp. Agoura Hills, CA).
UV-vis spektralna analiza nanougljeničnih suspenzija
je vršena u opsegu talasnih dužina 500-1100 nm
pomoću Avantes UV-vis spektrofotometra na 20°C
uz automatsku korekciju za rastvarač (voda).
Materijal i metode



Iluminacija je vršena kontinualnim IC laserom talasne
dužine 808 nm (2 W/cm2, model „RLTMDL-808-1
W“proizvođača „Roithner LaserTechnik“), u trajanju
od 30-300 s.
Porast temperature je registrovan termoparom
uronjenim u suspenziju tako da nije bio direktno
izložen laserskoj svetlosti.
Analiza antitumorskog delovanja nanočestica je
izvršena na ćelijskoj liniji humanog glioma (U251).
Materijal i metode


Za procenu vijabiliteta korišćeno je bojenje kristal
violetom (CV) i MTT.
Analiza molekarnog mehanizma antitumorskog
delovanja nanočestica (apoptoza/nekroza,
oksidativni stres i depolarizacija mitohondrija)
vršena je primenom protočne citometrije.
Rezultati
Karakterizacija ugljeničnih
nanomaterijala
Karakterizacija grafenskih nanočestica
Large scale AFM images
Surface profile
Small scale AFM images
Karakterizacija grafenskih nanočestica

1.
2.
3.

Analiza dobijenih slika minimalno 200 grafenskih
nanočestica je ukazala da se u suspenziji GPVP
nalaze kao:
“single layer” čestice dijametra do 50 nm
“bilayer” čestice dijametra 50-70 nm
“multilayer” čestice dijametra 70-360 nm
Dominirale su “bilayer” čestice dijametra oko 70
nm debljine 2 nm.
Karakterizacija ugljeničnih nanotuba
Large scale AFM images
CNTSDBS
Surface profile
Small scale AFM images
Karakterizacija ugljeničnih nanotuba


Većina nanotuba CNTSDBS je u suspenziji formirala
snopove prosečne dužine 1.6 µm, dijametra oko 60
nm i visine 3 nm.
Morfologija CNTDNA je bila slična.
Karakterizacija ugljeničnih nanomaterijala


Na osnovu koncentracije nanomaterijala u vodenoj
suspenziji i njihove mase izračunata je koncentracija
nanomaterijala.
Ona je iznosila oko 1015 grafenskih nanočestica/l u
suspenziji koncentracije 20 µg/ml i oko 2 x 1012
CNTSDBS/l u suspenziji iste koncentracije.
Rezultati
Fototermalna senzitivnost grafena i
CNT
UV-vis analiza absorpcije zračenja bliske IC
oblasti od strane ugljeničnih nanomaterijala


CNT više apsorbuju
svetlost bliske IC oblasti
u odnosu na GPVP.
Kontrolni rastvori PVP,
DNA i SDBS nisu
apsorbovali zračenje
bliske IC oblasti.
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT


Suspenzije svih ispitivanih nanomaterijala su
pokazale porast temperature nakon ekspozicije
zračenju bliske IC oblasti koje je bilo zavisno od
njihove koncentracije kao i od dužine trajanja
ekspozicije.
Grafenske nanočestice su pod istim uslovima
generisale veći porast temperature u poređenju sa
CNT!!!
GPVP
CNTDNA
∆TG ~ 35°C
∆TCNT ~ 18°C
65
48
∆TG/ ∆TCNT ~ 2
GPVP
CNTSDBS
∆TCNT ~ 19°C
∆TG ~ 35°C
65
49
∆TG/ ∆TCNT ~ 2
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT



Sa druge strane, kapacitet povećanja temperature
nakon apsorpcije zračenja bliske IC oblasti je bio
skoro identičan za oba tipa CNT.
Iz ovoga se može zaključiti da način preparacije
ovih nano suspenzija ne utiče na njihovu
fototermalnu senzitivnost.
Veća fototermalna efikasnost grafenskih nano
čestica verovatno se može objasniti njihovom boljom
disperznošću
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

(1)
(2)
Uzimajući u obzir
termodinamička, optička
i geometrijska svojstva
ugljeničnih nano
materijala, upotrebili
smo sledeće jednačine:
∆Q = toplota
m = masa nanočestice
c = toplotni kapacitet
∆T = porast temperature
N = broj čestica u suspenziji
m1 = masa reprezantativnog
grafenskog “bilayer”-a tj.
ugljeničnog snopa nano
tuba
A = apsorpcija zračenja (808
nm)
S = površina nano materijala
koja apsorbuje zračenje
Ef = efikasnost apsorpcije
(2.3% za “layer” grafena tj.
20% za snop CNT)
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT


Aproksimovali smo da je razvijena toplota nakon
zračenja nanočestica i CNT bliskom IC oblsti istog
reda veličine.
Na osnovu jednačina (1) i (2) izvedena je jednačina
za odnos relativnog porasta temperature za
grafenske nanočestice i CNT:
dCNT = prosečan dijametar snopa
CNT
hG = visina grafenske
nanočestice
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT



Izračunata vrednost odnosa ∆TG/ ∆TCNT je ~ 3.5 i
slična je eksperimentalno dobijenoj vrednosti ~ 2.
Dakle, iako CNT imaju bolju fototermalnu
senzitivnost, generišu manju količinu toplote u odnosu
na grafenske nanočestice.
CNT, dakle, imaju tendenciju da agregiraju i
formiraju snopove usled čega su u rastvoru manje
dispergovane od grafena.
Rezultati
Fototermalna antitumorska efikasnost
grafena i CNT
Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i
CNT na U251 ćelije
Dozno i vremenski zavisna citotoksičnost prema U251 ćelijama glioma
Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i
CNT na U251 ćelije
GPVP
CNTDNA
U skladu sa izmerenim skokom temperature
nakon primene zračenja bliske IC oblasti,
grafenske nanočestice su pokazale nekoliko puta
bolju efikasnost u ubijanju tumorskih ćelija u
odnosu na CNT !!!
Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i
CNT na U251 ćelije
Rezultati
Molekularni mehanizmi grafenomindukovanog fototermalnog
antitumorskog delovanja
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja



Nekroza i apoptoza su dva glavna modaliteta
ćelijske smrti koja se u potpunosti razlikuju po
mehanizmu nastanka i morfološkim promenama koje
ih prate.
Nekrozu karakteriše gubitak integriteta ćelijske
membrane, stimulacija imunološkog odgovora i
oštećenje okolnih zdravih ćelija.
Apoptozu karakteriše fragmentacija nuklearne DNK
u odsustvu oštećenja membrane, koja eksponira
fosfatidilserin.
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja
U251 su bile izložene zračenju 3 min u prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja


Test aktivnosti LDH je ukazao na porast
permeabiliteta ćelijske mebrane u 50% ćelija (49.2
± 17.3; n=2)
Može se zaključiti da nekroza nije jednini
mehanizam fototermalnog antitumorskog delovanja
grafena.
FACS analize (morfologija ćelija)
24h
APOPTOZA
Smanjenje veličine ćelija
Porast granuliranosti ćelija
FACS – PI (fragmentacija DNK)
24h
FACS – Ann/PI (eksternalizacija fosfatidilserina)
NEKROTIČNE
24h
KASNA APOPTOZA
Ann-/PI+
Ann+/PI+
Ann-/PI-
Ann+/PI-
Ann-/PI+
Ann+/PI+
Ann-/PI-
Ann+/PI-
Ukupan broj Ann+ ćelija u
kontroli 9.4% a u tretmanu
95.5%
ZDRAVE
RANA APOPTOZA
FACS – ApoStat (aktivacija kaspaza)
24h
*p< 0.05 ANOVA
U251 su bile izložene zračenju 3 min u prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)
FACS – DePsi (depolarizacija mitohondrija)
4h
*p< 0.05 ANOVA
Gubitak mmp (DΨ)
FACS – DHR (produkcija ROS)
4h
*p< 0.05 ANOVA
FACS – DHE (produkcija superoksida)
4h
*p< 0.05 ANOVA
Zaključci:
1.
2.
3.
Grafenske nanočestice pokazuju fototermalno
antitumorsko dejstvo nakon pobuđivanja
zračenjem bliske IC oblasti.
Bolja disperznost i manja veličina grafenskih
nanočestica je odgovorna za superioran
fototermalni antitumorski efekat u odnosu na CNT
Mehanizam antitumorskog delovanja je
kombinacija apoptoze i nekroze usled indukcije
oksidativnog stresa i oštećenja mitohondrija.
Zaključci:
S obzirom na veliku površinu, malu
toksičnost i jeftinu proizvodnju, grafenske
nanočestice mogu biti potencijalni
kandidati za fototermalnu terapiju
maligniteta.
REALIZATORI ISTRAŽIVANJA
Katarina Arsikin
Aleksandar Pantović
Rukovodilac:
Vladimir Trajkovic