Transcript Le cellule dendritiche 1 26.05.2014 - e-learning

Il complesso sistema delle cellule
dendritiche
Dr. Luigi Lembo Fazio
Dipartimento di Biologia e Biotecnologia “Charles Darwin”
Sezione di Scienze Microbiologiche
Sapienza-Università di Roma
I due tipi di immunità…un po’ di storia
Immunita’ innata o naturale
pronta risposta (fase precoce)
controllo/
limitazione dell’infezione
Immunita’ adattativa o acquisita
tardiva)
eradicazione più lenta (fase
dell’infezione
Immunita’ di lunga
durata
APC
Innata
TLRs
NODs
Adattativa
Le DCs come sensori immunologici
• Controllano la durata e il tipo di risposta adattattiva
• La risposta adattativa è strettamente dipendente dalla natura dello
stimolo che le DCs ricevono
Ueno et al., Immunol. Reviews, 2007
L’equipaggiamento delle DCs
- Recettori Fc (FcR)
- Mac-1 (CD11-b/CD18, integrina aMb2): recettore del complemento CR3
utilizzato per l’uptake di batteri rivestiti con le opsonine
- CD14
- recettori per il mannosio appartenenti alla famiglia delle lectine (C-type lectin
receptors): impegnati nell’internalizzazione e nella presentazione di proteine
mannosilate
- TLRs
- Nods
Rescigno et al., Immunology & Cell Biology,1999
Che cosa analizziamo delle DCs?
1. Caratteri generali
2. Subsets delle DCs umane e murine:
a) eterogeneità delle DCs
b) localizzazione e funzione (DCs
dell’intestino)
3. Il processo di “maturazione”
4. I microrganismi patogeni e le DCs
Chi sono le cellule dendritiche (DCs)?
1. Le DCs costituiscono una famiglia eterogenea di cellule presentanti
l’antigene (APC), componenti importanti del sistema immunitario:
- induzione e controllo della risposta dei linfociti T
- modulazione della risposta dei linfociti B
- attivazione del sistema immunitario innato (cellule NK, NKT)
2. L’attivazione dei linfociti T ad opera delle DCs si correla con la
straordinaria capacità di cattura, internalizzazione e processamento
dell’antigene, che viene successivamente riesposto complessato con le
molecole dei complessi maggiore di istocompatibilità di classe I e II (MHCI
e MHCII)
E non solo…
• Le DCs sono importanti anche nel mantenimento della
tolleranza immunitaria, centrale e periferica
1. Tolleranza centrale
- Eliminazione delle cellule T autoreattive
2. Tolleranza periferica (tolleranza orale)
Presentazione degli antigeni ai linfociti T in assenza di molecole di
costimolazione (anergia)
- Delezione delle cellule CTL e NK
- Induzione di cellule regolatorie inducibili CD4+ T
- linfociti CD4+ CD25+ (Treg)
Le sfide del sistema immunitario
1. La frequenza con cui i linfociti entrano in contatto con i
microrganismi è relativamente bassa
2. Le cellule infettate esprimono bassi livelli dei complessi
peptidi/MHCII
3. Le cellule infettate mancano delle molecole di costimolazione
È in questo contesto che si insericono le cellule dendritiche
1. Riconoscono e catturano i microrganismi
2. Presentano gli antigeni complessati con le molecole MHC
3. Forniscono i segnali essenziali per il differenziamento e
l’aspansione clonale dei linfociti
Dall’iniziale scoperta….
….ai giorni nostri
1. Esistono molti e ben distinti subsets di DC
-
Localizzazione tissutale
-
Microambiente (all’interno dello stesso tessuto/organo)
-
Specializzazione funzionale (commitment)
-
Diversità nei pathway di sviluppo e differenziamento
-
Potenziale migratorio
-
Espressione dei PRRs (TLRs, NODs, C-type lectins)
2. Il sistema delle DC è quello maggiormente soggetto a
cambiamento (steady-state vs. infezione/infiammazione)
3. Nella maggioranza dei casi, le DC presentano un’emivita
relativamente breve, quindi devono essere continuamente
rinnovate
The Strange Case of Dr.Jekyll and Mr. Hyde
Mr. Hyde
1. Differenze nella risposta contro virus, batteri, funghi, elminti
2. Priming linfociti T e linfociti B
3. Differenze nell’induzione di una risposta protettiva rispetto
alla tolleranza
4. La polarizzazione verso un fenotipo Th1 vs. Th2 o di una Treg
vs. Th17
Dr. Jekyll
1. L’esistenza di numerosi subsets di DC genera confusione
(solo nel topo sono stati individuati e caratterizzati almeno 6
subsets)
2. Le conoscenze provengono dall’analisi di modelli murini o da
colture primarie umane mantenute in condizioni di
differenziamento non standard
Shortman AND Naik, Nat Rev Immunol 2007
Come possiamo classificare le DC?
La classificazione dei subsets di cellule dendritiche viene generalmente
effettuata utilizzando diversi parametri
1. Origine di sviluppo
2. Proprietà biologiche-funzionali (fenotipo, funzione e
localizzazione)
Limiti:
1. Non sempre si conoscono in maniera dettagliata i pathway di ontogenesi e
differenziamento delle DC
2. Anche la classificazione basata sul fenotipo può determinare confusione: è
questo il caso delle DC della mucosa intestinale (CX3CR1 e CD103 vs.
CD11b e CD8a)
La classificazione ottimale dei subsets di cellule dendritiche è quella che tiene
conto contemporanemente delle proprietà biologiche, del microambiente in
cui le DC sono presenti e del fenotipo
L’ontogenesi delle DC
 Inizialmente considerate di origine mieloide (hanno caratteristiche in comune
con i macrofagi, possono essere fatte derivare dai monociti)
 CD8a+ vs. CD8a Tutti i subsets di DC possono formarsi dal CLP e dal CMP
90%
Shortman AND Naik, Nat Rev Immunol 2007
10%
Come possiamo classificare le DC?
Una delle più semplici…
1. Cellule dendritiche convenzionali (cDC)
2. Precursori delle cellule dendritiche (pre-DC)
1. Cellule dendritiche convenzionali (cDC)
Hanno caratteristiche morfologiche e funzionali tipiche delle DC in condizioni di
steady-state.
2. Precursori delle cellule dendritiche (pre-DC)
-
Sono al penultimo stadio del differenziamento in senso dendritico
-
Necessitano di poche o nessuna divisione cellulare
-
Lo sviluppo dei pre-DC a DC avviene tanto in condizioni di steady-state,
quanto sotto la pressione di un Danger Signal
Cellule dendritiche convenzionali (cDC)
1. DC con potenziale migratorio
2. DC residenti negli organi linfoidi
1. cDC migranti
- Sono le DC dei tessuti periferici, che in seguito al riconoscimento e alla cattura degli
antigeni migrano, attraverso la linfa, ai linfonodi, dove presentano I complessi
antigene/MHC ai linfociti.
- Il riconoscimento degli antigeni (Danger Signal) innesca un processo di maturazione
che si conclude negli organi linfoidi.
Es. Cellule di Langherans dell’epidermide e dei tratti respiratorio, gastrico e urogenitale; DC dermiche e DC interstiziali.
2. DC residenti negli organi linfoidi (milza, timo, MLNs)
-
Non hanno capacità migratorie
-
Possono trovarsi in uno stato “immaturo” o “maturo”
-
Importanti anche nel mantenimento della tolleranza
Precursori delle DC (pre-DC)
1. Pre-DC
- In condizioni di steady-state non hanno caratteristiche morfologiche e funzionali tipiche
delle DC
- Sono cellule di forma rotondeggianti, circolanti nel sangue
- L’acquisizione del fenotipo dendritico avviene in seguito alla stimolazione con
componenti virali e batterici
Es. Cellule dendritiche plasmacitoidi pDC: natural interferon-producing cell.
2. Cellule dendritiche infiammatorie
Rientrano in questa classe quelle popolazioni di DC che non si ritrovano in
condizioni di steady-state ma solo in seguito all’instaurarsi di processi
infettivi/infiammatori.
Es. Tip DC
Ancora qualche dettaglio
Le DC possono trovarsi in due stati funzionalmente distinti:
1.
Immature
Tessuti periferici; sono cellule con una spiccata attività fagocitica
Organi linfoidi
2.
Mature
Organi linfoidi; cellule specializzate nella presentazione antigenica
Possiedono un’elevata espressione delle molecole co-stimolatorie (CD80,
CD86)
N.B.
Processo di migrazione costante (anche se a un tasso relativamente
basso) di DC immature/semimature dai tessuti periferici ai linfonodi
drenanti (DC coinvolte nella tolleranza)
Il processo di “maturazione”
[..In the steady state, DCs reside in both
peripheral tissues and lymphoid organs. DC
subsets also circulate in the blood. To elicit antimicrobial immunity, DCs undergo a complex
process of maturation, a ‘metamorphosis’ from an
antigen-capturing cell into an antigen-presenting
cell (APC)…].
Ueno et al., Immunol. Reviews, 2007
Il processo di “maturazione”
•
Combina una serie di cambiamenti morfologici e funzionali
1.
2.
3.
Perdita delle strutture di adesione
Riorganizzazione del citoscheletro
Acquisizione delle capacità migratorie (cambiamento
nell’espressione dei recettori per le citochine e chemochine)
4.
5.
Perdita dell’attività fagocitica
Up-regolazione delle molecole costimolatorie CD80 (B7.1),
CD86 (B7.2), CD40, CD83, CD38 e dell’MHCII
Secrezione di chemochine
Secrezione di citochine che differenziano e polarizzano gli
effettori della risposta adattativa
6.
7.
(modificata da Hackstein e Thomson, 2004)
Il processo di “maturazione”
Banchereau and Palucka, Nat. Rev. Immunol. 5, 296-306 (2005)
Subsets di cDCs murine (organi linfoidi)
• Le cellule dendritiche vengono continuamente prodotte all’interno del
midollo osseo a partire da cellule staminali ematopoietiche (HSC).
• Si ritrovano in organi linfoidi e non linfoidi.
• Si ritrovano in almeno tre compartimenti: tessuti periferici, organi linfoidi
secondari e circolanti nel sangue
• Tutte le sottopopolazioni esprimono livelli più o meno elevati dell’integrinaa CD11c, MHCII e molecole costimolatorie (CD86 e CD80)
MILZA: 3 sottopopolazioni
CD8a+ CD11b- DEC205+ (CD8a+ “lymphoid” DC)
CD8a- CD11b+ DEC205- CD4+ (CD8a- CD4+ “myeloid” DC)
CD8a- CD11b+ DEC205- CD4- (CD8a- CD4- “myeloid” DC)
LINFONODI: altre due sottopopolazioni
CD8adull CD11b+ DEC205+ CD4- Langerine+ (LCDC)
CD8a- CD11b+ DEC205+ CD4- Langerine- (dermal DC)
E come ultima popolazione…
pDC: CD11bdull MHCIIdull B220+ CD8a+ CD4+ (B220+ DC)
Bali Pulendran Immunol. Reviews, 199: 227-250 (2004)
Subsets di DC umane [1]
 2 Principali pathway di ontogenesi a
partire dal progenitore ematopoietico
CD34
 Flt3-ligand (FLT3L) sembra essere il
principale fattore che governa l’omeostasi
delle DC in condizioni di “steady-state”.
Banchereau and Palucka, Nat. Rev. Immunol. 5, 296-306 (2005)
Bali Pulendran Immunol. Reviews, 199: 227-250 (2004)
Subsets di DC umane [2]
 Tutte le cellule dendritiche umane esprimono elevati livelli delle molecole
dell’MCHII (HLA-DR)
 Mancano però dei marcatori tipici della linea linfoide, quali il CD3 (linfociti
T), il CD19/20 (linfociti B) e il CD56 (NK)
Cellule dendritiche mieloidi. Rappresentano la controparte murina delle
DCs convenzionali CD11c. Si caratterizzano per l’espressione del CD11c,
CD11b, CD13…
Cellule dendritiche plasmacitoidi. Mancano dei marker tipici della
differenziazione mieloide e possono essere distinte per l’espressione del
CD123, CD303….
Cellule di Langherans. Sono cellule dendritiche presenti negli strati più
interni dell’epidermide. Hanno capacità migratorie. Si distinguono per
l’espressione della langherina
Cellule dendritiche CD14. Sono le DCs inizialmente indicate come
interstiziali. Si ritrovano sia nei tessuti periferici, sia nei linfonodi. Anche
questo subset mostra positività per il CD11c
Subsets di DC umane [3]
• La maggiorparte delle conoscenze deriva da studi condotti sulle
DC circolanti o da sistemi cellulari in vitro
Bali Pulendran Immunol. Reviews, 199: 227-250 (2004)
Mucosal DC
L’epitelio intestinale
Epitelio gastrointestinale:
epitelio semplice più
vulnerabile all’invasione
microbica
 Versante luminale
 Versante basale
pH: 7/7.5
Temperatura: 37°C
Epitelio bagnato da fluidi
Le difese dell’epitelio intestinale [1]
Mucina
Mistura di glicoproteine prodotte dalle cellule “goblet”, che
intrappola i batteri prevenendone l’accesso al versante luminale
LATTOFERRINA
Proteina di legame al ferro
che depriva i batteri di un
importante fattore nutritivo
LISOZIMA
sIgA
Enzima che scinde il
legame β,1-4 del
peptidoglicano (PGN)
Aumentano la viscosità
della mucina
Le difese dell’epitelio intestinale [2]
 Cellule ciliate
 Produzione di DEFENSINE (cripte del piccolo e largo intestino)
“Killing” dei batteri
Protezione delle cellule staminali epiteliali
 Microflora residente: prevalenza di batteri Gram-positivi
(Lactobacilli, Bifidobatteri)
 MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) o
GALT (gastrointestinal-associated lymphoid tissue )
Il tessuto linfoide associato all’intestino (GALT)
- Lamina propria del piccolo e grande intestino (SITI EFFETTORI)
- Placche del Peyer (SITI INDUTTORI)
- Linfonodi mesenterici (MLN) (SITI INDUTTORI)
- Follicoli linfoidi isolati
GALT
Mucosal DCs
Perchè analizziamo le cellule dendritiche intestinali?
 Il sistema immunitario intestinale deve essere in grado di discriminare
tra patogeni e antigeni safe come quelli appartenenti al microbiota
derivanti dalla dieta
 Le DCs della mucosa intestinale hanno sviluppato funzioni uniche:
- Induzione dei linfociti T regolatori
- Guidano lo switching isotipico (IgA)
- Consentono ai linfociti T e B di acquisire i recettori essenziali
per l’indirizzamento verso la mucosa intestinale (gut- homing
receptors)
A livello del tratto gastro-intestinale le DCs si ritrovano in almeno tre
compartimenti:
1. Peyer’s patches (PPs)
2. Lamina propria (LP)
3. Linfonodi mesenterici (MLNs)
DCs delle Placche del Peyer
M cell
Rescigno, Adv Immunol (2010)
PPsDC
PPs: almeno 6 sottopopolazioni
CX3CR1+
CD8a- CD11b- CCR6+
CD8a- CD11b+ CCR6CD8a+ CD11b- CCR6pDCs (non sembrano produrre interferoni)
CCR7+
Lamina Propria DCs
LP DCs: nel topo sono stati descritti numerosi subsets di DC.
1. Possono trovarsi negli strati più profondi della LP o in stretto contatto con
l’epitelio associato al follicolo (FAE)
2. Da un punto di vista fenotipico i diversi subsets possono essere distinti
sulla base dell’espressione di diversi marcatori: CD11c (alta o bassa
espressione), CD11b, CD103, CX3CR1 e CD70.
3. Da un punto di vista funzionale si distinguono sulla base dell’espressione
dell’integrina aE, CD103 (recettore per l’E-caderina): CD103-, CD103+
Le cellule DCs della LP: le CX3CR1+
1. Le DCs CX3CR1+ formano delle strutture simili alle tight-junctions con le cellule dell’epitelio
intestinale ed emettono i loro dendriti direttamente nel compartimento luminale, dove
possono campionare e catturare i diversi antigeni presenti
2. Chemochina CX3CL1 (fractalchina): fattore delle cellule epiteliali essenziale per il
reclutamento delle DCs, linfociti T, NK
3. Il numero di queste estensioni (TEDs: trans-epithelial dendrites) varia considerevolmente
in relazione al segmento di intestino analizzato
4. La formazione di queste protrusioni è dipendente dal microbiota e dall’interazione con i
recettori TLRs (modelli murini germ free e trattati con antibiotici)
5. In condizioni di steady state l’ileo presenta un numero inferiore di TEDs rispetto alla porzione
del piccolo intestino
6. In seguito a infezione con Salmonella si assiste a un aumento del numero dei TEDs
Le cellule DCs della LP: le CX3CR1+
Chieppa et al., JEM, 2006
Campionamento degli Ag
Cattura degli antigeni
Dipendente dalle cellule M
Dipendente dalle DC
Kelsall, B. L., and M. Rescigno. 2004. Nat. Immunol. 5:1091-1095
Dipendente dall frammento Fc
Le cellule DCs della LP: le CD103

Da un punto di vista funzionale si distinguono sulla base dell’espressione
dell’integrina aE, CD103 (recettore per l’E-caderina): CD103-, CD103+

Pathway ontogenetico diverso: CD103+ derivano da pre-DCs. CD103- da
precursori monocitari

Diversità nella richiesta di fattori di crescita e di differenziamento: Flt3 per le
CD103+, GMCSF per le CD103-

Capacità migratorie

Presentazione antigenica

Diversità nell’assetto genico: le DCs CD103+ esprimono livelli più elevati di
CCR6, CCR7, TLR5 e TLR9 e più bassi livelli di molecole costimolatorie e degli
altri TLRs rispetto alle CD103-
Inducono la
differenziazione dei Th17
Rescigno, Adv Immunol (2010)
Le cellule DCs CD103+

Possiedono caratteristiche uniche

Sono in grado di promuovere l’espressione dei recettori gut-homing, CCR9 e
a4b7 sui linfociti B e T naive

Sono cellule dendritiche con funzione tolerogenica in grado di promuovere il
differenziamento dei linfociti Treg

Il differenziamento dei Treg avviene a livello dei MLNs

Due sono i principali fattori responsabili del differenziamento dei Treg: l’acido
retinoico (RA) e il TGF-b

La produzione diacido retinoico (RA) e di TGF-b guida anche la produzione di
IgA ad opera dei linfociti B (Microbiota e Treg e IgA)
Le cellule DCs CD103+

Le cellule CD103+ esprimono l’enzima indoleamina 2,3 diossigenasi (IDO),
anch’esso richiesto per la funzione tolerogenica

IDO è coivolto nel patway catabolico del triptofano

La generazione di metaboliti tossici, quali le chinurenine, da un lato inibisce la
generazione di cellule T effettrici, dall’altro promuove la differenziazione di
cellule T regolatorie.

L’inibizione in vivo dell’enzima IDO determina nei modelli murini di colite (DSS)
una perdita della tolleranza orale accompagnata da una manifestazione più
violenta della patologia
Le cellule DCs CD103+

Studi molto recenti sembrano indicare che le cellule dendritiche CD103+
possano agire in sinergia con uno specifico subset di macrofagi nell’induzione
della tolleranza orale e nella differenziazione dei Treg
Rescigno, Adv Immunol (2010)
Le cellule DCs della LP e i linfociti Th17

Due subsets di DCs: CD11b+ TLR5
CD11clow CX3CR1+ CD70


Le cellule CX3CR1 CD70 esprimono una serie di recettori per l’ATP
Inducono la differenziazione dei linfociti Th17 in presenza di ATP ma
indipendentemente dalla stimolazione del TLR5
Rescigno e Dii Sabatino, 2009 Science Medicine
Uematzu and Akira, J. Gastroenterol (2009)
Le DCs della LP e il commitment

Le cellule dendritiche CD103+ hanno funzione tolerogenica
 Esiste un “commitment” delle DCs e conseguentemente
esistono subsets spcifici di DCs
 Condizionamento in seguito all’interazione con le IEC e/o con
fattori rilasciati dalle IEC
Scott et al, 2011 Trends Immunol.
La famiglia delle poietine e
l’espansione delle DC
BMDC
Shigella-infected BMDC
hDC
Shigella-infected hDC
D1
Shigella-infected D1