Transcript Diapositiva 1

UN TESORO NASCOSTO NEL NOSTRO
OLIO DI OLIVA:
IL POTERE ANTIOSSIDANTE
Il valore aggiunto che sappiamo offrire per
mezzo di un'analisi innovativa
12 Novembre 2011
Aula Magna I.T.T. G. e M. Montani
Fermo
Teresa Cecchi, PhD
[email protected]
Il valore aggiunto che sappiamo offrire per
mezzo di un’analisi innovativa
•
•
•
•
•
Radicali liberi
Potere antiossidante dell'olio d'oliva
Metodi attualmente disponibili per la sua stima
Punti di forza del nuovo metodo
Suggerimenti per lo sviluppo di nuove nicchie
di mercato: sapere per crescere
Malattie e danni causati all’organismo







Invecchiamento stesso, secondo la “Free Radical Theory”: le ROS danno un danno
ossidativo attaccando il DNA, le proteine e i lipidi (Arking, 2006, The biology of aging:
observations and Principles, 3rd Ed. Oxford, UK, Oxford University Press.
ISBN:9780195167399)
Arteriosclerosi dovuta al danno ossidativo dei lipidi (da parte del radicale peridrossilico
HOO∙) nella parete dei vasi sanguigni, patologie del sistema cardiocircolatorio
(ipertensione, aterosclerosi, ictus, infarto)
Sviluppo di tumori dovuto al danno provocato dall’ossidazione del DNA
Danno tessutale nell'artrite reumatoide e nelle patologie infiammatorie dell'intestino, quali
il morbo di Crohn e la colite ulcerativa.
Malattie neurodegenerative, quali il morbo di Parkinson, la Sclerosi Laterale Amiotrofica
(SLA) e l’Alzheimer.
Invecchiamento e fotoinvecchiamento della pelle: rilascio di proteasi che agiscono sul
collagene e sull'elastina, discromie, diminuzione del tono e dell’elasticità,
assottigliamento, secchezza, rughe.
Cataratta
Gli antiossidanti endogeni ed esogeni
limitano i danni dei ROS
Le cellule possono tollerare uno stress ossidativo blando, che spesso è superato grazie
all’esistenza di efficienti sistemi di difesa antiossidante.
Gli antiossidanti prevengono l'azione distruttrice del radicale libero reagendo con esso e
formando nuovi radicali scarsamente reattivi secondo la reazione seguente:
Ar-OH + R• → Ar-O• + RH
•
•
Antiossidanti enzimatici, endogeni
–
superossido dismutasi: 2O2-• + 2H+ → H2O2 + O2
–
catalasi: 2H2O2 → 2H2O + O2
–
glutathione peroxidase: 2GSH + H2O2 → GSSG + H2O
Antiossidanti non-enzimatici, anche esogeni: Vitamina C, vitamina E, vitamina A,
co-enzyme Q10, glutathione, acido alpha lipoico, polifenoli, l’acido urico, la
bilirubina, e la melatonina.
I polifenoli: 8000 strutture che prevengono
l'ossidazione!
•
•
•
Non Flavonoidi
–
Acidi Idrossibenzoici: Acido Gallico, Acido p-Idrossibenzoico
–
Acidi Idrossicinammici: Acido caffeico, ferulico
–
Idrossi-isocromani
–
Idrossistilbeni: Resveratrolo
Alcoli fenolici
–
(3,4-dihydroxy-phenyl)ethanol (3,4-DHPEA o hydroxytyrosol)
–
(p-hydroxyphenyl)ethanol ( p-HPEA o tyrosol)
Flavonoidi
–
Flavonoli: Quercetina, Miricetina, Rutina, Canferolo
–
Antocianine (e proantocianidine): Delfinidina, Cianidina, Malvidina, Peonidina
–
Flavan-3-oli
•
Monomeri: Catechina, Epicatechina, Proantocianidine
•
Tannini condensati
–
Flavanoni: Hesperitn
–
Flavoni: Apigenina, Luteolina
–
Isoflavoni
–
Calconi
•
Lignani, derivati dalla fenilalanina, fitoestrogeni: (+)-1-Acetoxypinoresinol, (+)-1-Pinoresinol
•
Secoiridoidi: presenza dell'acido elenolico o dei suoi derivati. UNICAMENTE NELL'OLIO DI OLIVA!!!!!!
Il tesoro nascosto nell'olio d'oliva
•
Da ricercare nella frazione insaponificabile (circa 2% del peso dell’olio di oliva)
•
Più di 230 sostanze chimiche appartenenti a diverse classi
–
alcoli alifatici e triterpenici, steroli, idrocarburi (squalene) e composti volatili, responsabili
dell'aroma
–
Antiossidanti la cui composizione non può essere ritrovata in alcun altro olio
•
Caroteni
•
Tocoferoli (α-, β-, γ-, δ-tocoferolo )
•
sostanze fenoliche idrofile formate durante il processo di estrazione meccanica
dell’olio dai composti fenolici presenti nell’oliva, in particolare, in ordine di
quantità presenti
–
Secoiridoidi: oleuropeina, demetiloleuropeina, ligstroside, forma
dialdeidica dell’acido elenoico legata al 3,4-DHPEA, o p-HPEA (3,4DHPEA-EDA o p-HPEA-EDA) e oleuropeina aglicone (3,4-DHPEA-EA).
Tipici delle Olearaceae che include la Olea europaea
–
Lignani: (+)-1-acetossipinoresinolo and (+)-1-pinoresinolo e (+)-1idrossipinoresinolo
–
Acidi fenolici vari derivanti dall'acido benzoico o cinammico
–
Alcoli fenolici: (3,4-dihydroxy-phenyl)ethanol (3,4-DHPEA o hydroxytyrosol)
e (p-hydroxyphenyl)ethanol (p-HPEA o tyrosol)
–
i flavonoidi: apigenina e luteolina
L'olio d'oliva è un “nutraceutical”
Da Hippocrate (460-377 BC) a Leonardo da Vinci (1452-1519) si è sempre ritenuto che "la vita di un uomo dipende
da ciò che mangia".
•
Inibizione dell'aggregazione piastrinica da parte del 3,4-DHPEA (Petroni, et al. Thromb. Res. 78, 1995,
151-160)
•
Effetto inibitorio dei fenoli idrofilici dell'olio d'oliva sulla ossidazione delle LDL (Visioli,et al.
Atherosclerosis 117, 1995, 25-3)
•
Attività protettiva del 3,4-DHPEA sul danno ossidativo degli eritrociti e diminuzione del rischio di
trombosi e ritardo del danno aterosclerotico (C. Manna, al. J. Nutr. Biochem. 10, 1999, 159-165).
•
Capacità del 3,4-DHPEAdi inibire la proliferazione ed indurre apoptosi nelle cellule tumorali conferente
all'olio d'oliva una proprieta anticancro (R. Fabiani, et al: European Journal of Cancer Prevention (2001)
•
Effetto antiplroliferativo dell' oleuropeina e hydroxytyrosol sulle cellule MCF-7 del cancro del seno (Han
et al. Cytotechnology, 59, 2009, 45-53)
In generale, negli ultimi anni studi pubblicati su giornali scientifici ad alto impact factor confermano che circa un
terzo dei casi di cancro sono collegati all'alimentazione e la dieta mediterranea, basata sul consumo di olio
d'oliva, conferisce protezione rispetto lo sviluppo del tumore e rispetto alle malattie cardiovascolari e
diabete; inoltre si è dimostrato che l'olio d'oliva modula la funzione immunitaria e ha una chiara azione
antinfiammatoria.
I polifenoli idrolfilici tipici dell'olio d'oliva si sono dimostrati più attivi di molecole generalmente considerate
antiossidanti quali la Vitamina E (Carrasco et al. J.Sep.Sci. 28, 2005, 837)
Servili et al. Phenolic compounds in olive oil: antioxidant, health and organoleptic activities according to their
chemical structure, Inflammopharmacology, 17, 2009, 76
Necessità della stima del potere antiossidante:
quantizziamo questo valore aggiunto!
•
Poiché il tesoro nascosto nell'olio d'oliva è il suo potere
antiossidante, dovuto in particolar modo alla frazione fenolica, il
settore olivicolo potrà crescere sfruttando tale segreto della
salubrità della dieta mediterranea.
•
Serve un metodo che lo stimi in modo quantitativo, veloce,
preciso ed accurato e che permetta la classificazione
merceologica degli oli secondo questo parametro
•
Serve uno stimolo all'introduzione di tale metodo nei regolamenti
ufficiali eutropei (EEC 2568/91 e successive modifiche) per
l'analisi degli oli per innovare radicalmente questa possibilità
analitica
Aprroccio analitico separativo
COI/T.20/Doc No 29/2009
•
Estrazione con MeOH: H2O 80/20, bagno ad ultrasuoni, centrifuga
•
Separazione analitica da 82 minuti in duplicato, bianco, standard esterno
•
Quantificazione, difficile per i diversi fattori di risposta al detector
•
Mancanza di standard commerciali per ogni singolo composto naturale,
necessità di conferme con tecniche strumentali molto costose (Wellwood and
Cole 2004).
•
The concentration of phenolic com-pounds, evaluated colorimetrically, was
highly correlate
•
Procedura lunga e laboriosa (circa 6 ore per campione), risultati controversi
•
Baldioli et al. 1996; Owen et al. 2000; Montedoro et al. 1992; Bendini et al.
2007.
Mancanza di informazione sull'attività specifica di ogni molecola
Risultato della separazione
Approccio analitico olistico
•
•
•
Determinazione della capacità antiossidante
globale del campione in esame
Correlazione di tale capacità antiossidante
globale con la composizione della miscela di
antiossidanti determinati con l'approccio
separativo
Individuazione delle molecole responsabili
maggiormente del potere antiossidante e
delle eventuali sinergie
Disponibilità di metodi per la stima del potere
antiossidante: metodi HAT vs ET
Metodi HAT
L'antiossidante compete con la sonda ossidabile fluorescente per radicale perossidico ROO·generato
termicamente da un azo radical iniziatore idrosolubile, normalmente AAPH (2,​2'-​azobis-​2-​methyl​propanimidamide, dihydrochloride)
ROO• + Sonda (fluorescente) → ROOH + Sonda ossidata (perdita di fluorescenza)
L'analisi quantitativa si fa per paragone della cinetica di ossidazione (area sotto la curva di decadimento) della sonda
fluorescente in presenza o assenza dell'antiossidante poichè esso ritarda l'ossidazione, usando come
standard antiossidante il Trolox (derivato della vitamina E solubile).
Crocin bleaching assay, si misura la capacità dell'antiossidante di proteggere lo sbiancamento della crocin
da parte del AAPH, difficili applicazioni quantitative:



la velocità di reazione di sbiancamento inibito dall'antiossidante purtroppo non è sensibile alla
variazione della concentrazione dell'antiossidante stesso
Interferenze e variabilità da lotto a lotto della crocina .
TRAP (total radical trapping antioxidant parameter assay): R-phycoerythrin (proteina) come sonda,
difficili applicazioni quantitative:



variabilità da lotto a lotto
Interazioni aspecifiche con I polifenoli fanno diminuire la fluorescenza anche senza aggiunta di
generatori di radicali
ORAC (oxygen radical absorbance capacity assay): fluoresceine come sonda


Fintanto che gli antiossidanti presenti sono in grado di catturare i radicali, essi proteggono la
fluoresceina dal decadimento poi essa perde parte della sua fluorescenza. Il tempo di decadimento
della sonda fluorescente risulta proporzionale alla quantità ed attività degli antiossidanti presenti nel
Metodi ET
Si basano sulla capacità di un antiossidante di ridurre un ossidante che, cambiando colore in tale processo, permette di
dosare l'antiossidante dalla curva ABS vs C.

TEAC (Trolox equivalence antioxidant capacity assay) l'ossidante è ABTS· -(2,2'-azino-bis(3ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)). La concentrazione di antiossidante che dà una percentuale di cambio
dell'assorbanza del ABTS·- pari a quella di 1 mM Trolox è la TEAC.



I valori FRAP sono stati spesso in contrasto con le proprietà riducenti delle molecole stesse, e il
tempo del test (4 min) si è dimostrato assolutamente insufficiente per i polifenoli
DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical) usa come ossidante un radicale stabile e commercialmente
disponibile, la cui riduzione viene misurata a 515 nm finchè il decadimento è finito. La concentrazione di
antiossidante che dà una diminuzione della concentrazione iniziale di DPPH del 50% è definita come EC50


La diversa velocità di reazione dei vari antiossidanti non si riflette nei valori TEAC perché esso è
un saggio di end-point e ciò ne abbassa l'affidabilità.
FRAP (ferric ion reducing antioxidant power assay): la unità FRAP come la quantità di antiossidante capace di
ridurre 1 mol di Fe(III) a Fe(II)


Sfortunatamente manca la correlazione fra i valori TEAC e il numero di elettroni dati
La stabilità del DPPH lo differenzia dai radicali dello stress ossidativo e della perossidazione
lipidica ROS radical. Alcuni antiossidanti importanti dal punto di vista biologico potrebbero
addirittura non reagire con esso

La cinetica di reazione non è lineare con la concentrazione di DPPH

Si sono osservate reazioni reversibili
FCR: Metodo Folin-Ciocalteu; il reagente non è specifico per I polifenoli poichè può essere ridotto da una
grande quantità di sostanze come la vitamina C, il Cu (I) etc....
Debolezza dei metodi attualmente usati per la
stima del potere antiossidante (Huang et al. 2005).
Gli antiossidanti testati non affrontano mai quei ROS che nell'organismo
umano causano il danno ossidativo
Il radicale usato non è simile a uno di quelli prodotti nello stress
ossidativo nei sistemi biologici
La sonda non è simile ai substrati che in-vivo vengono attaccati dai
radicali liberi
Nel test ORAC la concentrazione del substrato è minore di quella
dell'antiossidante il che è in contrasto con le situazioni reali,
rendendo poco interessanti le informazioni fornite
Mentre l'anione radicale superossido e H2O2 sono degradati in vivo
dalla SOD e catalasi, non si conoscono protezioni enzimatiche nei
confronti di HOO· e HO·, quindi su di essi dovrebbe concentrarsi un
metodo affidabile della stima del potere antiossidante
Punti di forza del nuovo metodo
E' l'unico test in-vitro che simula condizioni in-vivo perché gli antiossidanti debbono
affrontare chimicamente nella miscela di reazione gli stessi radicali liberi e i loro
precursori responsabili di invecchiamento e malattie e cioè HOO· and H2O2. Inoltre il test
misura l'attività di quelle molecole capaci di prevenire la formazione del devastante
radicale HO· attraverso la reazione di Fenton, poiché catturano quei metalli che la
catalizzano.
Lavora a pH≤2, tipico dei fluidi gastrici nei quali la perossidazione lipidica è amplificata
(Kanner and Lapidot 2001).
E' semplice, non costoso, rapido
Si è modificata la reazione di BR per tener conto della non solubilità dei campioni in acqua
Non si misura il potere antiossidante di un estratto dell'olio perchè ciò non potrebbe rendere
conto di sinergie antiossidant (Papadopoulos and Boskou 1991) ma si è analizzato
direttamente l'olio.
Il metodo è basato sulla risposta cinetica ottenuta da una reazione oscillante che genera
radicali liberi simulanti lo stress ossidativo in-vivo. Quando scavengers di radicali attivicome i polifenoli- sono aggiunti alla miscela oscillante le oscillazioni si inibiscono per un
tempo che è proporzionale alla quantità ma anche alla attività della molecola antiossidante
aggiunta.
Il servizio
Bisogni dei consumatori che si intende soddisfare.
Dato che l’olio di oliva gioca un ruolo cruciale nel prevenire lo stress
ossidativo causa di invecchiamento e numerose patologie un bisogno
fondamentale dei consumatori è poter ottenere una misura quantitativa della
capacità dell’olio extravergine di oliva di fornire composti antiossidanti che
sono capaci di spazzare via i radicali liberi.
Bisogni dei produttori che si intende soddisfare.
La soddisfazione del bisogno dei consumatori di cuisopra diventa fonte di
business per i produttori che spesso sono piccole aziende locali ma con forte
potenzialità di espansione nel mercato globale se solo potessero certificare la
qualità dei loro prodotti.
Finalità e risultati attesi
•
•
•
•
•
Introduzione di questo nuovo metodo di analisi potrebbe generare
lavoro indotto nei laboratori di analisi degli alimenti attualmente
presenti nel territorio italiano
impulso alla commercializzazione dei materiali e strumenti necessari
per realizzarlo.
Il servizio innovativo potrebbe incrementare il business dell’olio di
oliva che rappresenta un settore importantissimo nell’economia
italiana.
poiché il metodo riesce a lavorare sulla matrice alimentare
direttamente e senza pretrattamente potrebbe essere esteso ad altri
cibi fonti naturali di antiossidanti (vino, thè, frutta e verdura etc…)
con coinvolgimento di ampi settori dell’industria alimentare
Finalità non meno importante è quella di riscattare la reputazione
della scienza chimica purtroppo spesso a torto vista come causa dei
mali dell’ambiente. Il Chimico assume un ruolo affine a quello del
medico o del farmacista poiché certifica il valore intrinseco di un
prodotto naturale.
Realizzazione
•
•
•
Svolgere l’analisi descritta non impiega più di una ora per una persona
(perito chimico) ben addestrata
I reattivi necessari allo svolgimento della stessa analisi sono: acqua
ossigenata, acido malonico, Iodato di sodio, Solfato di manganese, acido
gallico, acetone. Considerate le quantità utilizzate in una singlo analisi ed il
prezzo dei reattivi si può certamente dire che la spesa dei consumabili per
una singola analisi è inferiore ai 10 Euro. Vanno considerati poi i costi per il
personale (1 analisi per ogni ora lavorativa che supponiamo costi 25 Euro
lordi) e i costi in conto capitale per gli strumenti utilizzati (potenziometro,
PC, elettrodo) che possono ammontare a circa 3000 Euro.
Gli operatori da contattare in qualità di fornitori di tale servizio sono
• oleifici
• produttori di olio di oliva
• laboratori di analisi degli alimenti
• altri comparti dell’industria alimentare interessata a fare business
delle caratteristiche nutritive antiossidanti di un dato alimento
• agenti pubblicitari e dell’informazione di Massa
•
Abbiamo utilizzato e caratterizzato campioni di oli extravergini d'oliva
monocultivar italiani (2007, Marche) ottenuti in bottiglie di vetro verde scuro
dall’ ASSAM (Ancona) nel novembre 2007, conservati in al buio, alla
temperatura di 19°-21°C. Risultati preliminari illustrati di seguito mostrano
la fattibilità della realizzazione del servizio progettato e proposto
Oscillogramma della reazione oscillante in
assenza di sostanze antiossidanti
oscillogramma della reazione oscillante con
l’aggiunta di un estratto fenolico(polifenoli)
750
800
730
710
750
potential (mV)
potential (mV)
690
700
650
670
650
630
610
590
600
570
550
550
0
100
200
300
time (s)
400
500
600
0
100
200
300
time (s)
400
500
600
La linearità fra tempo di inibizione e quantità (microlitri) di
antiossidante contenuto nell’olio extravergine di oliva
aggiunto è perfettamente dimostrata nel grafico seguente
dove è stata anche inserita l’equazione matematica della
retta di regressione; il coefficiente di determinazione
mostra l’ottima correlazione raggiunta.
tempo di inibizione (s)
250
y = 2.3621x - 134.24
R2 = 0.9828
200
150
100
50
0
60
70
80
90
100
110
120
130
microlitri della soluzione di olio aggiunti
140
150
160
Suggerimenti per una linea di ricerca
che non si spezzi e faccia crescere il
nostro territorio....
•
Il potere antiossidante e il profilo fenolico dell'olio come parametri
di tipicità attraverso l'ANOVA
•
Oli d'oliva arricchiti nella frazione polifenolica come functional
food
•
Studio degli effetti sulla frazione fenolica e sul potere
antiossidante delle condizioni estrattive per ottimizzare la
produzione di oli ad alto potere antiossidante attraverso la
modulazione dell'attività della ossidasi polifenolica e perossidasi
•
Estrazione dei polifenoli dalle acque di vegetazione attraverso
l'uso di funghi/pelli di babana/enzimi
•
Uso della frazione fenolica come antiossidante dei cibi
concorrente di quelli attualmente in uso
Suggerimenti per una linea di ricerca
che non si spezzi e faccia crescere il
nostro territorio....
Suaarez et al. Development of a PhenolEnriched Olive Oil with Phenolic
Compounds from Olive Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 58,
2010, 10396
Inarejos et al., Effect of crushing on olive
paste and virgin olive oil minor
components, European Food Research
and Technology, 232, 2011, 441.