Transcript 5`-RACE

cDNA 5′ 端的快速扩增法
（5′RACE 法）
(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)
目
的
扩增5′端未知的
基因（DNA）序列
报告内容
● 使用试剂与方
法
● 实 验 例
实验使用的主要试剂
1.
2.
3.
4.
TaKaRa 5′
-Full RACE Core Set
TaKaRa LA Taq 酶
5条DNA扩增用引物
切胶回收试剂盒
5 ’ RACE原理
●Self-Ligation 法
5’ RACE 的实验方法
1.
2.
3.
4.
5.
6.
反转录（RT）反应。
Hybrid RNA的分解。
单链cDNA的自身连接。
PCR扩增5’未知区域。
目的DNA片段的切胶回收。
DNA序列测定。
实验例
（获取PSPtet RNA的5’末端）
1. 体外转录PSPtet RNA。
2. 配制PSPtet RNA和人总RNA的混合样品。
3. 设计合成5条引物。
4. 使用5’ RACE法获取PSPtet RNA的5’末
端。
5. 切胶回收目的DNA片段。
6. 进行DNA测序确认序列结果。
PSPtet RNA
体外转录
PSPtet RNA的电泳结果
1
M
1 ：PSPtet RNA
M：DL2,000 Marker
RNA Mixture 的配制
将PSPtet RNA与人总RNA按
1 ：105 的比例混合，此混
合物用于5’ RACE实验。
人总 RNA的电泳结果
1
M
1 : Human Total RNA
M :λHind III Marker
PSPtet RNA的5’端序列
AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAG
CTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTAT
GAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTA
GGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATT
CCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAA
TTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCA
GTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCA
CACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCG
CCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATC
GGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAG
GCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTG
CGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGG
AGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCA
GCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTT
CTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGG
CGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATT
CGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACG
T T T C G G C G A G A A G C A G G C C A T T A T · · · · · · · · · · ·
五条引物与PSPtet RNA的位置关系图
未知
序列
5’
3’
5条引物的详细序列
RT Primer：
5’-(p)AAAATGACCCAG- 3’
F1 Primer：
5’-GTCCTGTGGATCCTCTACGC- 3’
R1 Primer：
5’-AGCCACTATCGACTACGCGAT- 3’
F2 Primer：
5’-AGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTG- 3’
R2 Primer：
5’-CTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATA- 3’
实验例
（获取PSPtet RNA的5’末端）
1. 体外转录PSPtet RNA。
2. 配制PSPtet RNA和人总RNA的混合样品。
3. 设计合成5条引物。
4. 使用5’ RACE法获取PSPtet RNA的5’末
端。
5. 切胶回收目的DNA片段。
6. 进行DNA测序确认序列结果。
5’ RACE 的实验方法
1.
2.
3.
4.
5.
6.
反转录（RT）反应。
Hybrid RNA的分解。
单链cDNA的自身连接。
PCR扩增5’未知区域。
目的DNA片段的切胶回收。
DNA序列测定。
Step1. 反转录反应
1.反应液组成:
RNA Mixture
3.0 mg
10×RT Buffer
1.5 ml
RNase Inhibitor (40 U/ml)
0.5 ml
AMV Reverse Transcriptase XL (5 U/ml)
1.0 ml
5’ 磷标记反转录引物 (200 pmol/ml)
1.0 ml
RNase Free dH2O
up to 15 ml
2.反应条件:
30℃ 10 分钟→ 50℃ 30 分钟→ 80℃ 2 分钟→4℃ 保存
Step2. Hybrid RNA的分解
1.反应液组成:
1st Strand cDNA反应液
15 ml
5×Hybrid RNA Degeneration Buffer
15 ml
RNase H (60 U/ml)
1 ml
dH2O
2.反应条件:
30℃; 1 小时→乙醇沉淀
up to 75 ml
Step3. 单链 cDNA 的自身连接反应
1.反应液组成:
Step2 的 cDNA 沉淀物
ml
5×RNA (ssDNA) Ligation Buffer
8
dH2O
12 ml
40% PEG#6000
20 ml
T4 RNA Ligase (40 U/ml)
1
2.反应条件:
16℃; 过夜反应
ml
Step4. PCR 反应 (1st PCR)
1.反应液组成:
2.反应条件如下:
Step3 的连接反应液
1.0 ml
10×LA PCR Buffer II
5.0 ml
dNTP Mixture (2.5 mM each)
8.0 ml
Primer F1 (20 mM)
0.5 ml
Primer R1 (20 mM)
0.5 ml
TaKaRa LA Taq (5 U/ml)
0.5 ml
dH2O
up to 50 ml
94℃ 3 min
94℃ 30 sec
55℃ 30 sec
72℃ 30 sec
25 Cycles
Step4. PCR 反应 (2nd PCR)
1.反应液组成:
2.反应条件如下:
1st PCR 反应液
1.0 ml
10×LA PCR Buffer II
5.0 ml
94℃ 30 sec
dNTP Mixture (2.5 mM each)
8.0 ml
55℃ 30 sec
Primer F2 (20 mM)
0.5 ml
72℃ 30 sec
Primer R2 (20 mM)
0.5 ml
TaKaRa LA Taq (5 U/ml)
0.5 ml
dH2O
up to 50 ml
30 Cycles
2nd PCR反应结果
M
1
M : DL2000 Marker
1 ：PCR产物
Step5. 目的 DNA 片段的切胶回收
●切胶回收电泳结果如下
1
M
1 ：回收DNA片段
M ：DL2000 Marker
Step6. DNA 片段的序列测定
测序结果与五条引物间的关系
未知
序列
5’
3’
PSPtet RNA的5’端序列
AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAG
CTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTAT
GAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTA
GGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATT
CCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAA
TTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCA
GTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCA
CACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCG
CCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATC
GGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAG
GCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTG
CGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGG
AGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCA
GCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTT
CTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGG
CGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATT
CGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACG
T T T C G G C G A G A A G C A G G C C A T T A T · · · · · · · · · · ·
5’ RACE 法种类
1. 使用 RNA Ligase 的 5’ RACE 法
● Self-Ligation Method
● Adaptor-Adding Method
2. 使用TdT (Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase) 的 5’ RACE 法
Adaptor-Adding
Method 原理
TdT 法原理
几种 5’ RACE 法的比较
Method
连接效率 引物情况
可否进行
扩增特异性
Nested PCR
TdT法
中
含PolyG
不可
低
Adaptor-Adding法
低
特异性高
可
中
Self-Ligation法
高
特异性高
可
高
讨
论
1. 本实验成功获取了PSPtet RNA的5’ 末端。
2. 在mRNA 3’ 末端部分序列已知的情况下，可使用
TaKaRa 5’ RACE法有效获取其 5’ 末端序列。
3. 实验中注意以下环节，可提高实验成功率。
1）起始RNA的量与质量。
2）引物设计（●RT引物 ●特异性）。
3）5’ 末端未知序列的长度（尽量短）。