Transcript PLC
II - 1 신경세포 신호전달 및 분화 과정에서 Phospholipase C의 역할 연구 연구책임자 : 서 판 길 포항공과대학교 생명과학과 연구목표 1. 신경세포 신호전달기작에서 PLC-b isozyme의 분자적 정체 및 각 isozyme의 특이적 역할 규명 2. 신경 세포의 성장과 분화에 대한 PLC-g1의 역할 규명 3. PLC 결합 단백질에 대한 단세포 항체 개발 및 PLC 매개 신호전달 기작 연구를 위한 Assay Kit 개발 제1세부과제(서판길): Phospholipase C-b 매개 신호전달 기전 연구 제2세부과제(류성호): 신경세포 성장 및 분화에서의 Phospholipase C-g 의 역할 제3세부과제(정준호): 신호전달 관련 단백질의 단세포 항체 개발 및 신호전달감지 Kit 개발 II - 2 연구배경 PLC는 세포 신호 전달 기작의 핵심요소이다 Growth factors Neurotransmitters NT PIP2 PLASMA MEMBRANE PLC-b O P + O -O O- O O P O- RGS PLC-g P o P O GDP O GTP O- g O Ga b O- IP3 DAG + + ER Ca2+ PKC Signal Response Ryu S.H. et al.(1987). J.Biol.Chem. 262(26); 12511-12518 Ryu S.H. et al.(1987) PNAS, 84; 6649-6653 Min D.S. et al.(1993) J.Biol.Chem. 268; 12207-12212 Kim M.J. et al.(1998) J.Biol.Chem. 2273(6); 3618-3624 II - 3 연구배경 PLC isozyme은 특이적인 신호전달 체계를 구축하고 있다 Neurotransmitters Growth factors PIP2 PIP2 G PLC-g PLC-b IP3 P SH2 SH2 SH3 DAG Ca2+ PKC Excitation, Secretion ? ? IP3 DAG PKC Growth, Proliferation Lee Y.H. et al.(1993) BBRC 194; 665-670 Noh D.Y. et al.(1994) Cancer Res. 73; 36-41 Lee Y.H. et al(1994) J.Biol.Chem. 269;26842-26847 Bahk Y.Y. et al.(1994) J.Biol.Chem. 269;8240-8245 Baek S.H. et al.(1996) J.Biol.Chem. 271;8170-8182 Bae S.S. et al.(1998) J. Neurochem. 71;178-185 II - 4 연구배경 PLC에는 10 종류의 동위효소가 존재하고 있다 PLC-b (b1-4) PLC-g (g1&g2) PLC-d (d1-4) PH EF X Y C2 PH SH2 SH2 SH3 PH EF X PH EF X PH Y Y C2 Suh P.G. et al. (1988) J.Biol.Chem. 263;14497-14456 Suh P.G. et al.(1989) PNAS 85; 5419-5423 Suh P.G. et al.(1989) Cell 54; 161-169 Kim M.J. et al.(1993) BBRC 194;706-712 Bahk Y.Y. et al.(1994) J.Biol.Chem.269; 8240-8245 Kim M.J. et al.(1998) J.Biol.Chem. 273;3618-3624 C2 II - 5 연구배경 PLC-b isozyme은 각각 특이적인 신호전달 체계를 구축하고 있다 ? gb P L C -b 1 aq ? gb P L C -b 2 aq ? gb aq P L C -b3 Kim D.S. et al.(1997) Nature 389;290-293 ? g aq b P L C -b4 II - 6 II - 7 연구내용 GAL1 UAS PROMOTER lacZ reporter gene PDZ AD DNA-BD PLC-b(C) Brain cDNA AD PDZ PLC-b(C) transcription DNA-BD GAL1 UAS PROMOTER lacZ reporter gene Isolation of PLC binding protein genes by Yeast-Two hybrid system II - 8 연구결과 Table I. C-terminal putative PDZ binding motifs of PLC-bs PLC b isotypes C-terminal motif b1 b2 b3 b4 D-T-P-L E-S-R-L N-T-Q-L A-T-V-V cf) PLC g1 D-N-R-L Table II. Results of yeast two hybrid screening with C-terminal of PLC b3. pBHA clones pGAD10 clones HIS3 b-Gal C-terminal pGAD10 alone - - of PLC b2 NHERF PDZ1 - - (ESRL) NHERF PDZ2 - - Shank1 PDZ - - NHERF2 PDZ2 ++ +++ II - 9 D irect IP : a F la g A b D irect 연구결과 F la g -P L C b 3 a F la g A b B lo t : H is-N H E R F 2 B lo t : H A -N H E R F 1 a H is A b a HA Ab P L C -b 3 in teracted w ith N H E R F 2 G PCR NHE3 a b g P X ? Y P L C -b ? ? NH ERF2 ezrin PK A II - 10 연구배경 PC12 세포에서 PLC-g1 은 성장 및 분화신호전달을 매개하고 있다 EGF PI3K NGF P P P PLC-g1 Shc Grb2 Sos Ras Raf P P PI3K P PLC-g1 ? ERK Transient activation Proliferation Sustained activation Differentiation Lee Y.H. et al.(1995) FEBS Lett. 385;105-108 Lee S.J. et al.(1995) J.Biol.Chem.270(28);16378-16384 Bae S.S. et at.(1998) J.Neurochem.71;178-185 II - 11 연구내용 EGF, NGF PIP2 PI3K PIP3 X PLC-g1 Receptor SH223 Y IP3 p38 p120 Sos p97 Grb2 Ca2+ DAG ? NF-kB PKC Shc Ras Raf ERK Comparison of growth and differentiation among stable cell lines PLC-g1PC12 PLC-g1SH223PC12 PC12 VectorPC12 PLC-g1 SH22PC12 PLC-g1 SH3PC12 PLC-g1PC12 PLC-g1SH223PC12 PC12 VectorPC12 PLC-g1 SH22PC12 PLC-g1 SH3PC12 분화 성장 II - 12 연구결과 Neurite outgrowth in various stable cell lines II - 13 연구결과 PLC-g1에는 여러 종류의 단백질이 결합한다 PLC-g1에 특이적으로 결합하는 여러 종류의 단백질이 존재 Proteins p180 p120 p97 p85 p68 p43 p38 Tissue Normal Brain tumor + +++ ++ ++ + + + + + + + ++ Cell V-3Y1 g1/w-3Y1 + +++ +++ + + + + + ++ + ++ Remarks Sos Unknown Dynamin Unknown Unknown Actin Unknown Yeast-Two hybrid system으로 발견된 PLC-g1 결합 단백질의 유전자 Clones ST-3 ST-12 ST-21 ST-30 ST-48 ST-51 ST-71 ST-85 Characteristics Binding to SH223 domain Binding to SH3 domain Unknown Binding to SH3 domain Unknown Unknown Binding to SH223 domain Binding to SH223 domain Remarks Sos Dynamin Actin II - 14 II - 15 연구결과 g1 X g1 S H 2 N X g1 S H 2 C X SH 2 g1 S H 3 X SH 2 g1 S H 2 2 3 X SH 2 SH 2 SH 3 Y SH 2 SH 3 Y SH 3 Y SH 2 Y Y g1 S H 2 2 3 SH 2 SH 2 SH 3 X SH 2 SH 2 SH 3 Y g1 /Y 7 7 1 F X SH 2 SH 2 SH 3 Y g1 /Y 7 8 3 F X SH 2 SH 2 SH 3 Y T im e(h r) 60 48 36 24 12 0 Pc 12 +T et g1 /H 4 3 4 A P L C -g1 a ctin P L C -g1 in d u ction in P C 12/T et-O ff system