Transcript LezionePOLARIMETRIA2014_15

Esperienza di polarimetria
Dott. Alfonso Zoleo
Laboratorio di Metodologie Spettroscopiche per le Biotecnologie AA 2014-2015
Concetti fondamentali
La luce possiede una proprietà chiamata polarizzazione. La polarizzazione
descrive la direzione di oscillazione del campo elettrico dell'onda.
Si dice che la luce è polarizzata linearmente se il campo elettrico oscilla
sempre su un piano. In figura è mostrata un'onda polarizzata linearmente: il
campo elettrico oscilla sempre sul piano xy (e il campo magnetico sempre sul
piano xz)
y
E
Piano xy
z
B
x
Se guardo
un’onda
polarizzata
linearmente che
viene verso di
me, il campo
elettrico lo
“vedo” oscillare
così
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Concetti fondamentali
Si dice che la luce è polarizzata
circolarmente se il campo elettrico ruota
intorno alla direzione di propagazione. La
rotazione ha luogo alla frequenza propria
dell’onda. Il modulo del campo elettrico è
costante.
Se guardo un’onda polarizzata
circolarmente che viene verso di
me, il campo elettrico lo “vedo”
ruotare
La luce prodotta da una lampada (o la luce solare) è non
polarizzata (il campo elettrico oscilla casualmente in ogni
direzione).
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Concetti fondamentali
Dobbiamo inoltre considerare che il campo elettrico è un vettore, e
quindi esso può essere sempre rappresentato ugualmente bene come
somma delle sue componenti lungo direzioni prefissate:
z Ez(t)
E(t)
Ey(t)
x
y
In questo esempio ho scomposto il
vettore campo elettrico dell’onda, posto
in una direzione qualsiasi (perpendicolare
alla direzione di propagazione x), in due
vettori diretti lungo y e lungo z. Sussiste
la relazione:
E (t )  E z (t )kˆ  E y (t ) ˆj
ˆj = versore diretto lungo y
kˆ = versore diretto lungo z
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Concetti fondamentali
Il polarizzatore è un dispositivo che lascia passare solo la componente
del campo elettrico della luce che è diretta secondo un asse (detto di
polarizzazione)
direzione
di propagazione
della luce
Luce
polarizzata
linearmente
lampada
lente
polarizzatore
Luce non polarizzata
Concetti fondamentali
Quando un fascio di luce polarizzata linearmente, con il campo elettrico inclinato
rispetto all’asse polarizzatore, incide sul polarizzatore, la componente del campo
perpendicolare all’asse viene bloccata: rimane solo la componente lungo l’asse.
I= intensità della luce. E’ proporzionale al quadrato del campo elettrico della
radiazione
E cos(q)
E
q
E sen(q)
I0=k E2
E cos(q)
Intensità della luce prima di
attraversare il polarizzatore
Asse del polarizzatore
I=k E2 cos2(q)
Intensità della luce dopo aver
attraversato il polarizzatore
I=I0 cos2(q)
Legge di Malus!!
Importanza dell’attività ottica in biologia
Molte sostanze (dette otticamente attive) ruotano di un certo angolo il
piano della luce polarizzata linearmente che attraversa una soluzione che le
contiene. Praticamente tutte le sostanze di interesse biologico (enzimi,
zuccheri, proteine) sono otticamente attive
Misurare la variazione di attività ottica di una sostanza biologica è un modo
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per studiare reazioni e cambiamenti di quella sostanza
Potere ottico rotatorio (POR) di una sostanza
Definizione
L'angolo di rotazione α del piano della luce polarizzata (in gradi) diviso
per la lunghezza di cammino ottico attraverso il mezzo (b, in dm),
diviso a sua volta o per la concentrazione in massa (c, in g/ml) della
sostanza (potere ottico rotatorio specifico [a]λq ) o per la
concentrazione molare (potere ottico rotatorio molare [am]λq ) .
Il POR specifico (o molare) di una sostanza dipende dalla lunghezza
d’onda della luce polarizzata e dalla temperatura. Convenzionalmente si
usa luce gialla monocromatica a 589 nm (riga D del sodio), e la misura è
effettuata a 20°C
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Molecole otticamente attive
Sperimentalmente si osserva che tutte le soluzioni di composti
enantiopuri ruotano il piano della luce polarizzata.
D-alanina
Enantiomero S
L-alanina
Enantiomero L
Enantiopuro = composto che contiene solo un tipo di enantiomero
Enantiomero = uno dei due stereoisomeri di una molecola che sono immagini
speculari non sovrapponibili l’uno dell’altro
Carbonio chirale
Tutti gli aminoacidi
biologici (tranne la
glicina) sono chirali,
ovvero solo una delle
forme è usata
biologicamente
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Gli Zuccheri
Consideriamo
un esempio
* sono centri chirali
enantiomeri
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I monosaccaridi (aldosi) semplici sono soggetti alla formazione di semiacetali
In soluzione il D-glucosio forma due diastereoisomeri
Quando una delle due forme viene sciolta in acqua, lentamente si ottiene un equilibrio delle due
forme con il 36% della forma α e il 64% della forma β. Il P.O.R. misurato cambia quindi con il
tempo (Mutarotazione), fino al raggiungimento dell'equilibrio. La soluzione deve essere quindi
lasciata equilibrare prima di effettuare la misura.
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D-(+)-galattosio
82
D-(+)-glucosio
52.7
(destrosio)
D-(-)-fruttosio
-89.5
(D-Levulose)
Saccarosio
66.5
(glucosio-fruttosio)
Saccarosio invertito
-20 (25 C)
(glucosio e fruttosio)
Maltosio
138.5
(dimero del glucosio)
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L’ESPERIENZA: MISURA DEL POTERE OTTICO
ROTATORIO DI SACCARIDI
Il principio della misura è molto semplice:

Si prepara una soluzione dello zucchero di interesse a concentrazione nota

Si riempie con acqua o con la soluzione un tubo polarimetrico

Si predispone una fascio di luce polarizzata e lo si fa attraversare il tubo
Si trovano la orientazione della luce polarizzata in uscita quando nel tubo
c'è l'acqua e quando c'è la soluzione

Dalla distanza angolare fra le due posizioni del polarizzatore analizzatore
si calcola il potere ottico rotatorio

Vediamo la realizzazione pratica
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TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA
PRIMO GIORNO: Preparazione delle tre soluzioni del saccaride a
concentrazione nota.
-Le tre soluzioni devono avere una concentrazione compresa tra 0,05 g/ml
e 0,3 g/ml
-La preparazione viene effettuata in matracci da 50 ml
-Le tre soluzioni devono essere lasciate termostatare a 25°C per 24 h
(equilibrio anomerico)
TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA
PRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del
polarimetro
6) Tubo polarimetrico
8)Fotodiodo
4) Polarizzatore
6) Analizzatore
Componenti del polarimetro
1) Sorgente luminosa (LED o laserino)
2) Lente collimatrice del fascio
3) Chopper
7) Lente collimatrice
del fascio
TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA
PRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del
polarimetro
1) Mettere per prima la lampada (il LED) sulla rotaia
2) Piazzare sulla rotaia, davanta alla lampada, la lente collimatrice,
avendo cura che il centro del LED sia allineato con il centro della lente
(regolando altezza e posizione della lente)
3) Spostare la lente lungo la rotaia fino a che il fascio appare allineato:
verificarlo usando un foglio e vedendo se lo spot luminoso dopo la
lente non cambia variando la distanza del foglio
50 cm
4) Piazzare la lente focalizzante a 50
cm dall’altra lente
5) Piazzare il fotodiodo nel
fuoco della lente
TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA
PRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del
polarimetro
6) Aggiungere il CHOPPER: il chopper è un disco con dei fori che ruota
azionato da un motorino elettrico. Variando la tensione dell’alimentatore del
motorino è possibile cambiare la frequenza di rotazione del disco. In questo
modo è possibile trasformare la luce continua in luce pulsata
7) Aggiungere il polarizzatore, il tubo polarimetrico e l’analizzatore
TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA
PRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del
polarimetro
8) Collegare l’oscilloscopio: il trigger dal chopper e il segnale in uscita dal
fotodiodo in ingresso
Perché usare il CHOPPER ?
Per avere luce pulsata. In questo modo sull’oscilloscopio si potra avere un segnale on
(quando la luce colpisce il fotodiodo) e off (quando il chopper blocca la luce). La
differenza delle due tracce è direttamente proporzionale all’intensità della luce che
colpisce il fotodiodo. Nota bene: l’oscilloscopio lavora solo con segnali nel tempo!
La sottrazione luce on-luce off consente di eliminare la luce ambientale!!
Chopper
Fotodiodo
Luce
Luce on
Luce off
Trigger
dal
chopper
Intensità della luce
Ext Ch1 Ch2
TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA
SECONDO GIORNO: Esecuzione della misura
1) Inserire l’acqua nel tubo polarimetrico. Mettere il tubo fra i polarizzatori
Analizzatore
2) Ruotare l’analizzatore finché il segnale sull’oscilloscopio scompare
TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA
SECONDO GIORNO: Esecuzione della misura
3) Ruotare in senso inverso (antiorario in figura) di 20° l’analizzatore (c’è
un goniometro per la lettura dei gradi)
20°
Analizzatore
4) Leggere l’intensità della luce (in mV) sull’oscilloscopio e l’angolo
leggibile sul goniometro dell’analizzatore in questa posizione
TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA
SECONDO GIORNO: Esecuzione della misura
5) Ruotare di 4° in senso orario l’analizzatore e prendere nuovamente il
valore di intensità (in mV) letto sull’oscilloscopio e l’angolo letto sul
goniometro
Analizzatore
6) Ripetere il punto 4) per un totale di 10 punti (spazzata di 40°)
TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA
SECONDO GIORNO: Esecuzione della misura
7) Svuotare il tubo polarimetrico e riempirlo con la soluzione zuccherina
più diluita
8) Ripetere la misura per la soluzione (punti 1-6)
9) Ripetere per le altre due soluzioni in concentrazione crescente (punti
1-8)
NOTA BENE: 1) Non cambiare configurazione ai polarizzatori nel passaggio da
una soluzione ad un’altra
2) Quando si passa da una soluzione all’altra, l’angolo di minimo (cioè quando
non si vede più segnale sull’oscilloscopio) va cercato in prossimità del minimo
precedente.
Parti dello strumento
Polarizzatori
Tubo polarimetrico
Lenti
Rotaia e supporti
Rivelatore
Sorgente a 589 nm
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ELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI DATI
Al termine del secondo giorno di lavoro, ogni gruppo avrà a disposizione i
seguenti set di dati:
1)Un gruppo di 10 punti (mV, angolo) acquisiti ogni 4° nell’intorno del minimo
per l’acqua pura
2)Tre gruppi di 10 punti (mV, angolo), acquisiti ogni 4°, nell’intorno del
minimo: un gruppo per ognuna delle tre soluzioni di zucchero
ELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI DATI
I punti acquisiti ogni 4° , relativi
all’acqua pura e alle soluzioni
zuccherine, vengono messi in
grafico con il software Origin.
Poiché i punti sono presi in una
zona limitata attorno al punto di
minimo, si assume che possano
seguire una parabola.
I punti vengono fittati in modo non-lineare usando l’equazione parabolica
nella forma ax2+bx+c
Il punto di minimo della parabola è dato da x0=-b/(2a)
ELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI DATI
Dalla differenza fra la distanza angolare di minimo x0 di ogni soluzione con la
distanza agolare di minimo dell’acqua si calcola il potere ottico rotatorio di ogni
soluzione:
ax0(sol)-x0(acq)
Riportando in grafico il POR di ogni soluzione contro la concentrazione, e
facendo un fitting lineare pesato con Origin, si ricava il POR specifico (o molare,
a scelta degli studenti):
ab c [a]
Relazione
Ogni gruppo deve presentare una relazione
sulla polarimetria
La relazione deve essere essenziale:
1)Max. una paginetta (= una facciata) di
introduzione con le basi e l’obiettivo del
lavoro
2)Max 4 pagine di parte sperimentale
Turni e gruppi
Mer
Gruppi 5/11/2014
Gio
6/11/2014
Ven
Mer
Gio
Ven
7/11/2014 19/11/2014 20/11/2014 21/11/2014
1
UV
Pol/UV
Pol
Elab
Rec
Rec
2
UV
Pol/UV
Pol
Elab
Rec
Rec
3
UV
Pol/UV
Pol
Elab
Rec
Rec
4
Pol
Pol
UV
Elab
Rec
Rec
5
Pol
Pol
UV
Elab
Rec
Rec
6
Pol
Pol
UV
Elab
Rec
Rec
Organizzazione
Mercoledì 5/11
14:00-15:00 spiegazione pratica UV-VIS e fluorescenza +
preparazione delle soluzioni zuccherine
15.00-18.00: Gruppi 1-3 esecuzione UV-VIS, gruppi 4-6 preparazione
soluzioni e montaggio del polarimetro
Giovedì 6/11
14:00-18:00: gruppi 1-3 preparazione soluzioni zuccherine +
elaborazione UV-VIS; gruppi 4-6 misure polarimetriche
Venerdì 7/11
14:00-18:00: gruppi 1-3 montaggio polarimetro e misure
polarimetriche; guppi 4-6 UV-VIS
Mercoledì 19/11
14:00-18:00: Elaborazione/Recupero