Transcript Malattie X
Ereditarietà X-Linked
Madre
X X
Padre
X Y
Figlia Figlio
Cromosoma X
Geni sottoposti ad inattivazione Geni attivi
Cromosoma Y
Regione pseudo-autosomica
X Inactive SpecificTranscript Xq13
circa 870 geni circa 80 geni - SRY - Geni della spermatogenesi
Cromosoma Y
Delezioni interstiziali dell’Y nel 5-10% dei soggetti con azoospermia o grave oligospermia non ostruttiva
Delezioni del cromosoma Y
Le microdelezioni del cromosoma Y rappresentano una causa importante di sterilità maschile con oligo- azoospermia e la loro identificazione • fornisce un corretto inquadramento diagnostico • permette di evitare trattamenti empirici costosi e inutili • ha importanti conseguenze etiche se il paziente è candidato per le tecniche di riproduzione assistita almeno 3 regioni importanti per la spermatogenesi
Casi di azoospermia o oligospermia severa :
il 5 10% è portatore di anomalie citogenetiche del cromosoma Y il 5 10% è portatore di delezioni sub microscopiche di Yq NON sono individuabili all’analisi del cariotipo (microdelezioni) ma possono essere identificate mediante
STS-PCR STS
“sequence tagged sites”
sono sequenze note di DNA genomico che possono essere amplificate tramite PCR
Int J of andrology (1999) – Hum Reprod (2001)
Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions
M.Simoni et al.
• elenco di STS da non utilizzare • set di STS primers consigliati: AZFa: AZFb: AZFc: sY84,sY86 sY127,sY134 sY254,sY255 Se viene trovata una delezione per valutare la esatta estensione si consiglia l’uso di altri STS che si trovino all’estremità prossimale e distale della regione (particolarmente importante per AZFa e b in pazienti candidati all’ICSI)
Multiplex a sY254 (c) sY 86 (a) sY127 (b)
Multiplex b
sY84 (a) sY134 (b) sY255 (c)
Frequenza delle microdelezioni Y
estema variabilità tra i vari studi (1%-55%) dipende dai criteri di selezione pazienti azoospermici o gravemente oligospermici (<5 milioni spermatozoi/ml) la percentuale è dell’ 11% (solo le forme idiopatiche : 18% ) se si considerano pazienti con più di 5 milioni di spermatozoi/ml la percentuale è inferiore all’ 1% Casistica laboratorio Genetica Medica: 1/600 AZFa 2/600 AZFb 12/600 AZFc 6/600 AZFb+c 2/600 AZFa+b+c Tot. 23/600 (3.8%)
AZFa DBY - UTY USP9Y* Del interstiziale AZFb RBMY1A (multicopia) Del interstiziale AZFc DAZ (4-7 copie) BPY2 CDY1 (2 copie una nel cluster DAZ una all’estremo 3’) Del interstiziale c Del terminale c Del interstiziale bc Del terminale abc rara rara Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS) Arresto della spermatogenesi alla pubertà prima o durante la meiosi comune intermedia Presenza di cellule germinali in vario stadio di maturazione ma pochi spermatozoi (periodo fertile giovanile) comune rara Fenotipo variabile dalla SCOS alla oligospermia Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS) Mutazioni puntiformi in USP9Y * in 2 maschi con ipospermatogenesi
Variabilità fenotipica delle delezioni • non costante correlazione genotipo-fenotipo • in genere: – azoospermia (84%) – grave oligospermia (meno di 1 x10 6 ml) (14%) – moderata oligospermia (1-5 x10 6 ml) (2%) • alterazione della spermatogenesi variabile anche in delezioni apparentemente simili • del Y anche in azoo- oligospermici con criptorchidismo o varicocele grave • del Y può promuovere la perdita del cromosoma con mosaicismo somatico 45X / 46XY • del Y molto centromeriche associate a bassa statura
Sex reversal
Inattivazione dell’X
solo uno dei due crom. X è attivo nelle femmine meno di 100 cellule Zigote femminile stadio di morula casuale innattivazione X pat. / X mat.
propagazione clonale
Inattivazione bilanciata dell’X
Cosa succede se una donna porta un gene non funzionante sull’X gene mutato Zigote femminile Innattivazione casuale X paterno / X materno il 50% delle cellule non esprime quel gene
Inattivazione dell’X
• Compensa le differenze di “dose genica” tra maschi e femmine • Alcuni geni sfuggono all’inattivazione (regioni pseudo autosomiche alle estremità del cromosoma X) • I geni XIST-TSIX in Xq13 sono essenziali per l’inattivazione • La metilazione è uno dei meccanismi dell’inattivazione
Inattivazione sbilanciata dell’X Perchè ?
• Un cromosoma X porta una mutazione LETALE • C’è una traslocazione bilanciata X ; autosoma • La regione che controlla l’inattivazione è alterata • E’ avvenuto “per caso”
Inattivazione Sbilanciata dell’X: effetto della selezione
gene mutato Zigote femminile Inattivazione casuale stadio embrionale Selezione nei tessuti in cui la funzione del gene è indispensabile
Malattie X-Linked recessive
Madre ( portatrice )
X X
Padre
X Y
Femmina SANA Femmina PORTATRICE Maschio MALATO Maschio SANO
Ereditarietà X-Linked recessiva
Ereditarietà X-Linked recessiva
Distrofia Musculare di Duchenne DMD
Giorgio Ester Enrico
Giorgio ha 3 anni
• modesto ritardo nell’iniziare a camminare • cammina con lentezza • ha difficoltà a stare eretto • non corre • all’esame obiettivo – ipertrofia dei gastrocnemi – debolezza dei muscoli prossimali • Creatina Kinasi (CPK) = 10,000 ui
Biopsia Muscolare
Controllo Normale Giorgio
Colorazione Ab anti-Distrofina
Controllo Normale Giorgio
Distrofina
proteina associata alla membrana : - il dominio N terminale lega l’actina - lungo dominio con 24 ripetizioni omologhe ad α-elica - una regione vicina al C-terminale ricca di cisteine che lega il calcio - il dominio C-terminale che lega altre proteine di membrana
Gene DMD
2,4 Mb (12 cMorgan) 8 promotori 79 esoni (0.6%) mRNA 14 kb trascritto in 16 ore
DM Duchenne :
mancata espressione di distrofina delezioni molto grandi (65-70%) , duplicazioni (10%) - mutazioni frameshift (10%), stop codon (5%) delezione “in-frame” con perdita delle regioni C-terminale o N-terminale (domini che legano le proteine)
DM Becker :
alterata qualità o quantità di distrofina delezioni “in-frame” (85%) di cui il 46% nella regione dei “spectrin repeats”
Ricerca diretta delle delezioni nella DMD - preparazione del DNA genomico - amplificazione con PCR multiplex di 9 o più esoni - separazione dei frammenti in gel di agarosio - visualizzazione con EB e raggi UV - fotografia (o immagine digitale)
Giorgio è affetto da Distrofia Musculare di Duchenne
• Diagnosi confermata da biopsia muscolare • Il test genetico non ha evidenziato delezioni ( delezioni-dupl. sono presenti nel 70% dei malati ) • Giorgio ha probabilmente una mutazione puntiforme Malattia X-linked recessiva - incidenza di 1 / 3300 tasso di nuove mutazioni di 10 -4 / meiosi (1/3 dei casi)
Albero famigliare allargato dopo colloqui con la cugina Rosa e la zia Giovanna Elena Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna
La cugina Rosa
vuol sapere che rischio ha di avere un figlio malato • Osservando la famiglia, la probabilità che Rosa sia portatrice è = 25% • Ancor prima del test genetico, si può migliorare la stima del rischio ?
Creatina Kinasi (CPK)
• fuoriesce dalle membrane del muscolo danneggiato • molto elevata nei maschi malati • livelli elevati solo in 2/3 delle portatrici – Giovanna e Rosa hanno CPK normale
Stima
“Bayesiana”
del rischio Probabilità “complessiva “ :
tiene conto della probabilita a priori di essere e di non essere portatore
( appartenendo ad dato albero famigliare )
e di altri fattori che modificano queste due probabilità (prob. condizionali)
Zia Giovanna : ha CPK normale e due figli maschi sani
Elena Giovanna CPK normale Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale
Quale è la probabilità che Zia Giovanna sia portatrice ?
Probabilità “ a priori ” Che lo sia Che non lo sia 1 /2 1 /2 con CPK Normale ?
con 2 figli Maschi Sani ?
1 /3 1 /4 1 1 Prob. condizionale 1/2 .
1/3 .1/4 = Prob. finale 1/24 1 /24 + 1 /2 = 1 / 13 1 /24 1 /2 1 : 12
Cugina Rosa :
ha 1/2 della probabilità di Giovanna e CPK normale Elena Giovanna CPK normale Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale
Il rischio a priori per Rosa è la metà di quello di Zia Giovanna 1/13 x 1/2 = 1/26
Quale è la probabilità che Rosa sia portatrice ?
Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/ 2 = Prob. “ a posteriori ” 1/26 .
.
1/3 = 1/78 1 /78 + 25 /26 = 1 / 76
Probabilità che Rosa possa avere un figlio affetto
Prob. di essere portatrice
X
rischio di trasmissione
1/ 76 x 1/4 = 1 / 304
1/304 è la probabilità che la cugina Rosa possa avere un figlio affetto Elena Giovanna CPK normale
(1/13)
Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale
(1/76)
Uso del Linkage nella malattia DMD ( mutazione non trovata ) Elena Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna
Analisi di linkage
• Linkage = concatenazione • Alleli corrispondenti a loci tra loro vicini sullo stesso cromosoma tendono ad essere trasmessi insieme (come una singola unità) durante la meiosi Allele 2 Gene wt Allele 1 Allele 1 locus polimorfico A (1, 2, 3, 4) Gene con mutazione Allele 3 locus polimorfico B (1, 2, 3, 4, 5)
2 wt 1 1 wt 1 1 Mut 3 2 Mut 3
Analisi di linkage
La frequenza di ricombinazione è una “misura della distanza” tra loci diversi : = 0.5
= 0 (50%) loci lontani (0%) = 0.02
loci vicinissimi (2%) loci vicini unità di misura = centiMorgan cM = 1 ricombinazione/100 meiosi
Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli Microsatellite C Microsatellite B Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli
Uso del Linkage: 1 marcatore
(A) 5’ UT ( e se ci fosse una ricombinazione tra mut. e marcatore? )
7 1
Elena
3 7 1
Enrico Ester Giorgio Rosa
1 7 3
Giovanna
Uso del Linkage: 2 marcatori
(A + D) ( c’è stata ricombinazione tra mut. e marcatore ? )
5 7 4 1
Elena
6 3 5 7
Giovanna
4 1
Enrico Ester Giorgio Rosa
4 5 6 1 7 3
Uso del Linkage: 2 marcatori
(A + D) Sarà stata trasmessa la mutazione ad Ester ?
2 9 5 7 4 1
Elena
6 3 5 7
Giovanna
4 1
Enrico Ester Giorgio Rosa
2 4 4 5 6 9 7 1 7 3
1 e 2 ricombinazioni tra marcatori
1 mut 1 mut 1 2 mut mut mut mut
Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli Microsatellite C 0.12
4 = 0.0002
4 ricombinazioni in 1 su 5000 casi Microsatellite B Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli
Se il marito di Rosa avesse un aplotipo 4-1 ??
5 7 4 1 4 1
Elena Nuove mutazioni 10 -4 / meiosi (1/3 dei casi)
6 3 5 7
Giovanna
4 1
Enrico Ester Giorgio Rosa
4 4 5 6 1 1 7 3
Analisi del rischio in famiglie X-linked
• Informazioni dall’ albero famigliare • Calcolo del rischio secondo
Bayes
• Ricerca della mutazione (test diretto) • Uso del linkage (test indiretto) • Attenzione alle ricombinazioni ! ( usare più marcatori… meglio se intragenici )
05/04/2005
Caso negativo per delezioni e duplicazioni DMD Frances co 1 1 1 2 2 3 2 2 1 Martina 1 2 1 2 2 3 2 1 1 3 2 1 2 1 1 1 1 1 62 82 14 Dav ide 16 2 2 3 1 3 1 1 1 1
5’-5N3
1 1
5’-7n4 STR44
2 3
STR45 STR49
2 1
DMD1-2c DXS1214 3’DYS MS introne 25 introne 49 1.2 kb a valle dell’esone 45 introne 62 esone 79
18
05/04/2005
Frances co 1 1 1 2 2 3 2 2 1 Martina 1 2 1 2 2 3 2 1 1 3 2 1 2 1 1 1 1 1 62 82 14 Dav ide 16 2 2 3 1 3 1 1 1 1 30 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 1 2 1 2 1 1 1 18 In caso di gravidanza
STR45 introne 25
ma
13.8 kb a valle dell’esone 44 1.2 kb a valle dell’esone 45 introne 49
: set - informativa solo la trasmissione X
p 3’DYS MS esone 79
05/04/2005
Frances co 1 1 1 2 2 3 2 2 1 Martina 1 2 1 2 2 3 2 1 1 3 2 1 2 1 1 1 1 1 62 82 14 Dav ide 16 2 2 3 1 3 1 1 1 1 30 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 2 2 3 2 2 1 1 1 1 2 2 3 2 2 1
introne 1 - 25 esone 63 - 79
18