Transcript 15. Vectoren en klonering in hogere organismen

Vectoren en klonering in hogere organismen : dierlijke cellen
(Primrose & Twyman : hoofdstuk 12)
 Onderzoeksbelang :
• studie genfunctie - genregulatie
• aanmaak recombinante eiwitten - juiste posttranslationele modificaties
- vorming van correcte disulfidebruggen
protein disulfide isomerase (PDI) in endoplasmatisch reticulum
van alle eukaryoten ; vorming van S-S bruggen ; eveneens chaperone.
- aminozuurverwijdering van het oorspronkelijke polypeptide
- O-linked of N-linked glycosylaties
=> ongeveer 30% van de eukaryotische proteinen zijn geglycosyleerd
• manipuleren van endogeen genoom => gentherapie
 Commercieel : synthese, o.a. vaccins, hormonen in zoogdier-celculturen
 “Gene delivery” voor dierlijke cellen in vivo versus in vitro : gentherapie
• 4 hoofdstrategiën voor horizontale gentransfer
• chemische - fysische “transfectie”/transformatie
• DNA-”delivery” met bacteriële vectoren
• virussen als gentranfervectoren
• Plasmidevectoren : dierlijke + bacteriële componenten
• Selectiemerkers
Gentransfer (DNA- transfer) naar dierlijke cellen
(DNA opname : Primrose & Twyman, pp. 218-227)
4 hoofdstrategiën van transformatie
“niet-biologisch”
- Transformatie - fysisch
- Transformatie - chemisch – endocytose
- ‘Bactofection’ – bacterie-gemediëerd
- Transductie – virus-gemedieerd
“biologisch”
*
DNA transfer via chemische of fysische weg
• Chemische methoden – transformatie (transfectie)
 complex zodanig dat interactie met celmembraan bevorderd wordt
vb. Positieve lading  opname door endocytose
Lipofiel complex  membraanfusie  DNA in cytoplasma
• Fysische methoden – transformatie (transfectie)
 door fysische kracht introductie van ‘naakt’ DNA
vb. micro-injectie – “particle bombardment” – electroporatie
– ultrasone behandeling
N ------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Chemische methoden – transformatie (transfectie)
 Calciumfosfaat co-precipitaat methode
- DNA/calciumfosfaat co-precipitaat afzetting op de
membraan en daarna internalisatie door endocytose
- migreert naar de nucleus voor expressie
- “coating” van cellen door het co-precipitaat is nodig ; werkt daarom
best voor cellen in monolayer- of suspensie-cultuur, maar niet erg
geschikt voor cellen in “clumps” (klompjes)
- 1-2% van de cellen nemen DNA op - slechts beperkte stabiele transformatie
- optimalisatie via specifieke buffersystemen voor trage precipitatie en
optimale balans tussen DNA, calciumfosfaat, buffer/pH
N
Diethylaminoethyl dextraan
dextraan
DEAE
 Gebruik van polyplexen
- DEAE-dextraan (diethylaminoethyldextraan) – een polykationisch polymeer
koolhydraat in complex met DNA
- polykationische componenten die spontaan oplosbare complexen
vormen (“polyplexen”) - elektrostatische interactie met DNA
- initiëel ontwikkeld voor “probleem”cellen die moeilijk te transformeren
waren met de calciumfosfaat methode
- nieuwe generatie polykationische componenten (zie Tabel 12.1 : Primrose & Twyman)
bvb. poly-L-lysine, spermine, polyethylenimine, dendrimeren
synthetische polyaminen (veel aminogroepen - positieve ladingen)
- ook voor in vivo gentransfer : controle over genexpressie en ‘gene delivery’
N
via specifieke polymeren met veranderende eigenschappen
bvb. onder invloed van temperatuursregulatie
 Liposomen en lipoplexen
- verpakking in liposoom (artificiële, ‘fusogene’ fosfolipidevesikels)
=> membraanfusie
(eerste voorbeeld : Schaffner in 1980 : fusie van bacteriële protoplasten met
dierlijke cellen om DNA binnen te brengen)
- kationische/neutrale lipidemengsels vormen stabiele complexen met DNA
=> lipoplexen
N
- mogelijkheid tot transformatie van grote DNA’s = “zachte” weg
- hoge efficiëntie van transformatie (tot 90% van de cellen) – zowel transiënt
als stabiel
- transformatie m.b.v. liposomen = lipofectie
- mogelijkheid van transformatie van cellen in
levende organismen na injectie in doelwitcellen (‘gene delivery’) : optimalisatie door
insertie van virale eiwitten die
celfusie promoten of targeting
naar specifieke cellen.
Kationisch liposoom in interactie met DNA = lipoplex
Fysische methoden – transformatie (transfectie)
 Elektroporatie
- transiënte vorming van poriën (nm-grootte)
- blootstelling aan elektrische puls - intensiteit/tijd - empirische optimalisatie
- eenvoudig - reproduceerbaar
- mogelijkheid in vivo gentransfer - op oppervlak met elektroden/naaldelektroden
 Ultrasone transfectie
- snel oscillerende probe (tip sonicator)
- ‘inklappen’ van membranen - ‘cavities’ – transiënte doorgang van DNA door
membranen
- zowel in vitro als in vivo ‘gene delivery’
Micro-injectie
- directe transfer tot in de cel
- enkel toepasbaar voor beperkt aantal cellen
- meestal toegepast op grote celtypes, bvb. oöcyten
- in vivo en in vitro
 “Particle bombardment”
- directe transfer tot in de cel
- initieel ontwikkeld voor transformatie van planten
- kleine metalen (gouden) partikels worden gecoat met DNA
N
en m.b.v. kracht geïntroduceerd
DNA transfer via biologische weg :
bactofection
Bacteriële gentransfer – bacteriële vectoren
• Transfer naar planten, m.b.v. Agrobacterium tumefaciens
(zie hoofdstuk 16 Plant)
• A. tumefaciens kan ook DNA introduceren in dierlijke cellen (2001)
• A. tumefaciens :
- transfer zonder invasie (blijft in de extracellulaire ruimte)
- aanhechting en vorming pilus : DNA transfer via een conjugatief mechanisme
• Bactofection van dierlijke cellen door invasie met de bacteriën :
- o.a. Salmonella spp., Listeria monocytogenese, Shigella flexneri
(mogen niet pathogeen zijn, kunnen desondanks storende neveneffecten
veroorzaken bij lyse ; of reacties bij gentherapeutische toepassingen)
- invasief  in cytoplasma (Listeria, Shigella) of in vacuole (Salmonella, Yersinia)
 opname in de cel, vervolgens lyse + vrijstelling van plasmide
 migreert naar de nucleus ; expressie naargelang de expressiesignalen
N
- verzwakking (‘attenuation’) nodig - zoniet vernietiging van de gastheercellen
 auxotrofe mutanten of stammen met induceerbare autolysis
• Toepassingen : o.a. gentransfer in vitro en in vivo : vb. afleveren van
recombinante DNA vaccins
nb. Bij ‘alternatieve gentherapie’ worden de bacteriën
N
actief behouden en wordt het eiwit in situ (in vivo)
tot expressie gebracht door de bacterie.
Vergelijking van de voornaamste vectortypes in functie van diverse parameters
Virale vectoren
Niet-virale vectors
Bacteriële vectoren
Veiligheid
+
+++
+
Efficiëntie
+++
+
+
Lage productiekost
+
++
+++
Eenvoud van productie
+
++
+++
Eenvoudige ‘delivery’
++
+
+++
Hoeveelheid toegeleverd DNA
++
+
+++
DNA transfer via biologische weg :
Virus- (of plasmide-)gemedieerd : transductie
Hier, gezien de historische context, behandeld samen met het exploreren van fysische of
chemische transformatiemethoden, aangezien dit samenging met de opbouw van de
eerste dierlijke virusvectoren ; transformatie met “vrij” DNA of met een replicon.
 De eerste experimenten (met fysische en chemische transformatiemethoden) werden initiëel
toegepast met complexe mengsels van DNA of afzonderlijke gensequenties, bij gebrek aan
vectorsystemen. Met de karakterisatie van het SV40 genoom kwam de eerste mogelijkheid
om virale en nadien plasmidevectoren te ontwikkelen
 Gebruik van plasmidevectoren :
Voordelen :
- gemak van in vitro manipulaties
- introductie van modulaire elementen (e.g. promotersequenties) die onafhankelijk van
het transgen bruikbaar zijn
- selectiemerker op het construct omzeilt de noodzaak van co-transformatie (transgen en
selectiemerker zijn gekoppeld : zie verder)
- mogelijkheid tot constructie van pendelvectoren - vereisen geen integratie in het
genoom - episomaal stabiel
 Runaway replicon : een replicon zonder, of induceerbaar tot verlies van, ’copy number’ controle :
deze afwezigheid of verlies leidt tot ongecontroleerde replicatie en extreme toename van het
aantal kopijen van het DNA waarin dit replicon ingebouwd is. Celdood kan een gevolg zijn
zodat toepassing vooral op DNA en eiwitproductie gericht is. Zie voorbeelden verderop.
"Klonering”
Transformatie gebeurt in twee ‘stadia’ :
 introductie van DNA in de cel (transfectie = algemene term voor onderscheid met infectie)
 incorporatie in de nucleus (veelal door integratie in het gastheerchromosoom)
Resultaat van transformatie :
 indien tijdelijke toestand = transiënte transformatie/transfectie - effect kortstondig
onderscheid dus tussen transiënte versus permanente (‘stabiele’) transformatie
=> ‘amplificatie’ mogelijk met methotrexaat
 integratie in het genoom - is overerfbaar - kan leiden tot stabiele transgene cellijn
 integratie = inefficiënt  selectie is vereist
=> het betreft hier transformatie van somatische cellen in cultuur (voor wijziging
van ‘germline’ cellen en eventuele aanmaak van transgene dieren zijn er andere vereisten) ;
slechts een kleine fractie van het inkomende DNA zal integreren in het cellulair
genoom maar kan aanleiding geven tot een nieuwe cellijn met nieuwe karakteristiek.
=> principe van ‘co-transformatie’ : het binnenkomende DNA concatemeriseert tot
grote moleculen vooraleer het integreert in het genoom. Twee verschillende DNA’s
hoeven dus niet gekoppeld te worden (mag uiteraard wel) : dit gebeurt in de cel. Een gen
samen met een selecteerbare merker bleken samen (in elkaars buurt) geïntegreerd te zijn.
Merkers en selectie, en reporters
Reporters :
(verdere informatie in Primrose & Twyman : pp.229-230 en 310-311)
- CAT : radiochemisch, chromatografie, ELISA (intracellulair)
- Alkalische fosfatase : kleur, fluorografie
(secretie)
- LacZ : kleurvorming, ...
- GusA : kleurvorming, ...
(gusA gen = uidA gen : glucuronidase-gen)
- luciferase (luciferine, ATP, Mg2+) : flash
- GFP (UV/blauw => groen fluorescent) en varianten
(vereist geen substraat ; vooral nuttig voor localisatie-experimenten)
Merkers :
- uit het nucleotidemetabolisme (TK, HPRT, APRT, ...)
- exogene, dominante (neo, nptII (aphII) : geneticine; ...)
- "amplificatie" : methotrexaat : competitieve inhibitie van DHFR
resistentie door - mutaties in DHFR
- verhindering opname
- verhoogde doelwitdosis
*
Merkers
Drie types selectiemerkers in zoogdiercellen
• Endogene selectiemerkers - bruikbaar bij mutante cellijnen
• Dominante selectiemerkers
• ‘Kwantitatieve’ selectiemerkers
Endogene selectiemerkers (Primrose & Twyman, voor een korte lijst in Tabel 12.2
Voorbeeld: Tk = thymidinekinasegen
en beschrijving in Fig 12.3)
 historisch : experiment met muiscellen deficiënt in TK - te transformeren met
Herpes Simplex Virus (HSV) Tk gen => resultaat : activiteit herwonnen
 transformanten te selecteren op HAT-medium (hypoxanthine - aminopterine thymidine) : aminopterine blokkeert de de novo synthese van dTMP (en
dus van dTTP)
 voor achtergrond : zie figuur op volgende slide - ‘de novo’ en ‘salvage pathway’
 toepassing : bij co-transformatie met andere transgenen die men wou overbrengen :
transfectie met 2 ongekoppelde DNA’s resulteerde in 90% co-transformanten ;
m.a.w. TK+ cellen waren ook positief voor het niet-selecteerbare gen (uit analyse
van deze regio bleek dat concatemeren tot 2 Mbp waren gevormd voor integratie optrad)
Endogene selectiemerkers : voorbeelden
DHFR
Uridine
Dominante selectiemerkers
(uitgebreide lijst in Primrose & Twyman, Tabel 12.3)
 bruikbaar voor alle gevoelige cellijnen – nieuw fenotype
 meestal antibioticumresistentiemerkers van bacteriële oorsprong
 neomycinefosfotransferase – resistentie aan aminoglycosideantibiotica
(kanamycine, neomycine, G418) – proteïnesynthese-inhibitoren
 selectiemerker wel onder transcriptieregulatie van eukaryotische elementen
te plaatsen (bvb. HSV Tk promoter, SV40 ‘vroege’ promoter)
‘Kwantitatieve’ selectiemerkers
(uitgebreide lijst in Primrose & Twyman, Tabel 12.4)
 stapsgewijze (random) amplificatie van de merker waardoor de cel ongevoelig
wordt voor lage dosissen van de inhibitor/’drug’
 toelaatbare concentratie – indicatie voor ‘kopijaantal’ transgen
 vb. dhfr-locus - dihydrofolaatreductase - methotrexaat is competitieve inhibitor voor
deze enzymatische activiteit : schakelt de novo synthese van dUMP en dIMP uit
toepassing: co-amplificatie van transgenen die gelijktijdig met DHFR geïntroduceerd
werden - expressieniveau tot zeer hoog op te drijven
Vb. methotrexaat-selectie voor grootschalige expressie : gradueel opdrijven van de
concentratie methotrexaat ; kan tot 10.000 maal de basis toxische concentratie tolereerbaar
maken (o.a. toegepast voor productie van weefselplasminogeenactivator).
Replicons
Repliconvectoren (viraal) - plasmidevectoren
Simian virus 40 (SV40) : eerste dierlijke virus dat onderzocht werd als mogelijke vector
sequentie van het DNA genoom (5224 bp) bekend in 1978
Geïsoleerd uit de Rhesus aap : in 1960 uit culturen van niercellen, die werden gebruikt voor de
aanmaak van het poliovaccin : controversieel toen bleek dat miljoenen mensen het hadden
gekregen via het gecontamineerde vaccin.
Papovaviridae (Papilloma, polyoma, vacuolating agent) (SV40 is een polyoma virus)
SV40 is “slapend” en asymptomatisch in Rhesus apen. Bij de mens kan het een nierziekte
veroorzaken. In andere species, vooral hamsters, veroorzaakt het tumoren. (Ook in de rat
werd een tumormodel ontwikkeld.) Een formeel bewijs van een rol van SV40 bij tumorvorming bij de mens ontbreekt (hoewel SV40-sequenties in heel wat tumoren gevonden werden).
Groei op niercellen van de aap (AGMK, CV1, …)
Structuur : 5243 bp (2 zeer kleine restrictiefragmentjes werden pas later ontdekt), circulair DNA
chromatinestructuur (nucleosomen) ; rol van histon H1 (zie foto volgende slide)
viruspartikel : icosahedraal, VP1, VP2, VP3
Genetische opbouw : "early" & "late" gebied, OR (replicatiefunctie)
Lytische ontwikkeling versus cellulaire transformatie
*
Vectoren voor dierlijke cellen, gebaseerd op SV40
*
*
SV40 ori-gebied
(details op volgende slide)
De origin voor SV40 DNA replicatie wordt voorgesteld door de ellips met erin een ruit
(tussen posities 5207 en 31). De belangrijkste elementen zijn een 27 bp palindroom en de
aansluitende 17 AT-bp sequentie ("AT-block").
Als nulpunt (G) is de centrale positie genomen van het 27 bp palindroom (positie 1 ligt dus
bij het volgende bp.)
Het ligt aan de rechterzijde van een unieke BglI herkenningsplaats.
cagaggccgaggcGgcctcggcctctg
BglI
GCCnnnnnGGC
........0123456789 nummering
Transcriptie van zowel het vroeg als laat gebied wordt geregeld door een (schijnbaar)
bidirectionele promoter die de AT-block, 21 bp herhalingen, en de sequentie van de
identische 72 bp gebieden omvat. (“schijnbaar” omdat deletie van sommige repeats een
verschillend effect heeft op vroege versus late transcriptie.)
Het kleinste ‘vroeg mRNA’ codeert voor groot-T antigen. Het grootste ‘vroeg mRNA’ voor
klein-T antigen, hoewel het gehele vertaalde gebied (dus ook het stoptriplet) voor de positie
van het intron ligt. Er is een (gemeenschappelijk) polyadenylatiesignaal, maar er is geen
specifieke afstand vereist (m.a.w. bij deletiemutanten verschuift de positie naar links of rechts).
Een groot intron zorgt voor het VP1 ‘laat mRNA’. De andere VP-eiwitten worden op
grotere mRNAs gecodeerd (kleinere introns, diverse groottes).
*
N
Transcriptiekaart van SV40.
ORI ligt op positie 5243/0
Vroege transcriptie in tegenwijzerzin.
2 mRNAs door verschillende
splicing (large-T + small-t)
Late transcriptie in wijzerzin.
2 mRNAs, één voor VP1,
andere voor VP2 + VP3
Gestippelde zones zijn de introns.
‘Runaway’ polyoma replicons – replicerend, maar celdood
SV40 DNA
*
•
•
•
•
•
•
•
•
2 transcriptie-eenheden : vroeg en laat
meerdere producten door alternatieve splicing
Vroeg : regulatorische eiwitten
Laat : capside-eiwitten
Regulatie: regulatorische sequenties tussen
vroege-late regio
In regulatorische regio :
vroege + late promoter, enhancer, ori
Vroege eiwitten : t en T tumor antigenen
T-antigen is vereist voor replicatie en de
oncoproteïne-eigenschappen
(Bemerk, en hou rekening met, de omgekeerde orientatie van de cirkel t.o.v. vorige figuur.)
N
Verloop van een SV40 infectie in permissieve en
in niet-permissieve cellen.
Tot ongeveer 14 uur na infectie (vroege fase) is de
de ontwikkeling gelijklopend.
- In permissieve cellen volgt dan DNA replicatie,
late eiwitsynthese, virusvorming en celdood.
- In niet-permissieve cellen integreert het virale
DNA in het cellulair DNA en kan “celtransformatie”
optreden als expressie van groot-T antigen aanhoudt.
Infectieproces
ontmanteling : 8 u
N
vroege fase: vroege mRNA's, vroege eiwitten : 4 u
start replicatie + late fase : late mRNA's en eiwitten : vanaf +/- 24 u
maturatie : inpakking en cellyse
Aanmaak COS cellen : SV40 DNA gelineariseerd met BglI (3 bp uitstekende uiteinden)
afsplitsing van de uitstekende uiteinden en ligeren
niet N
=> enkele bp in ORI verloren = ORI is inactief
transformatie cellen : detectie T-antigen (op basis van fluorescentie)
COS cellen : constitutieve expressie van T-antigen door het celgenoom
=> T-antigen wordt in trans voorzien.
Naam COS : CV-1 van oorsprong (Origin), met SV40
niet N
CV-1 : een cellijn afgeleid van niercellen van de African green monkey aap.
Immortalisatie door transformatie met het replicatie-deficiente SV40 DNA (COS cellen).
Brengt wel nog het T-antigen tot expressie.
Twee vormen van COS cellijnen : COS-1 (nog permissief voor lytische groei van SV40)
en COS-7 (bevat defectieve genomen maar zet geen infectieve viruspartikels vrij).
Belangrijkste karakteristieken
deels N
*
Basisgegevens :
replicatie : ORI : minimaal 70 bp
bi-directionele replicatie
bij elke replicatieronde is opnieuw T-antigen nodig
ORI : sluit promotoractiviteit in op beide strengen (tegengestelde richtingen)
- vroege mRNA’s : 19S (T en t)
- late mRNA’s : 16S (VP1) en 19S (VP2 en VP3)
Beperkte inpakmogelijkheid : tot 110% van het genoom
(30% deleties mogelijk)
=> dit limiteert vectorconstructie
Bij pendelvectoren ( zie verder) moet rekening gehouden worden met zogenaamde
“toxische” sequenties van pBR322 : dit zijn sequenties die de efficientie van
transformatie van dierlijke cellen verminderen. Zij zijn gesitueerd in het gebied
rond de nic/bom plaats van het plasmide.
Types SV40 vectoren : hoe, en welke, vectoren ontwikkeld op basis van SV40 elementen?
- transducerende vectoren (met helper virus) : inpakbaar, replicerend
late replacement vectors
early replacement vectors
in COS cellen
: 2 soorten virions
: 2 soorten virions
: zuivere virions
- plasmide vectoren : niet-inpakbaar, replicerend
N
gevolg van de vaststelling dat in COS cellen het viraal DNA repliceert, ook als
het late gebied verwijderd is. Er worden dan uiteraard geen virions meer
gevormd, dus geen plaques : er is bijgevolg een selectiemerker nodig. Er bleek
ook geen grootte-beperking qua inserties te zijn.
- passieve vectoren : niet-inpakbaar, niet-replicerend
het DNA kan niet repliceren (niet-permissieve cellen), maar is alleen behoudbaar
door integratie in het celgenoom. Dit werd mogelijk zodra selectiemerkers voor
dierlijke cellen beschikbaar waren (en is dus bruikbaar in een groot aantal
verschillende celtypes, ongeacht hun permissiviteit voor SV40).
- pendelvectoren met E.coli plasmide : "toxisch" gebied (uit pBR322) te vermijden
een SV40 replicon samengevoegd met een E. coli replicon.
ook twee selectiemerkers vereist, één voor elk van beide waardcellen.
Werken met :
Belangrijkste karakteristieken
N
(complementatie)
Complementatie van SV40
transducerende vectoren met
defectieve helpers (ts-mutanten).
Hetzij het "laat-DNA" (bovenaan)
hetzij het "vroeg-DNA" (onderaan)
is vervangen.
Een temperatuur-gevoelige
tsA mutatie geeft een mutant T,
een tsB mutatie een mutant VP1.
N
nb. in deze en volgende figuur :
vroegere nummering van het
SV40 DNA vanaf de EcoRI
knipplaats (in het VP1 gen) met
het late gebied in wijzerzin.
Complementatie door COS cellen,
van een SV40 tranducerende
vector zonder groot-T gen.
Het "laat-DNA" is vervangen door
nieuwe insertsequenties. Na
transfectie zijn alle eiwitten voor
replicatie en verpakking aanwezig :
T-antigen vanuit de COS cellen,
VP1, 2 en 3 vanop de vector.
niet N
Belangrijkste karakteristieken
Werken met :
niet N
N
N
SV40 plasmidevectoren.
Meestal pendelvectoren : bevatten ongeveer
2,3 kb pBR322 sequenties met de ori en het
bla gen, voor klonering in E. coli.
Het SV40 segment in de vector is het gebied
van 5171 tot 270 (in wijzerzin) waarin de
ORI ligt en ook de promoter-activiteit voor
vroege transcriptie.
Hierachter is een selectiemerker voorzien,
waarachter de SV40 sequenties voor
polyadenylering (rond positie 2500) liggen,
zodat een actief mRNA gevormd wordt.
pSV2 repliceert in COS cellen, maar niet in
gewone apencellen waarin geen groot-T
antigen aanwezig is. pSV3 repliceert wel in
gewone apencellen, aangezien het groot-T
groot-T gen ingebouwd is in de BamHI
plaats van pSV2.
pSV2 en pSV3 kunnen ook insereren in het
celgenoom en permanente transformatie
veroorzaken. Aldus groeit 1 cel op 104-105
tot een kolonie in aanwezigheid van
mycofenolzuur (een immunosuppressief agens).
-gpt
-gpt
Plasmidevectoren
N
Plasmidevector met expressie-eenheid op basis
van het oncovirus RSV (Rous sarcoma virus)
(RNA genoom) met LTR die specifieke
integratie in het gastgenoom mogelijk maakt,
evenals hoge genexpressie.
SV40 – virale vectoren
•
•
•
•
Samenvattend :
deels N
deels
*
eerste vectoren, virale vectoren  gentransfer via transductie ;  lytische infectie  virions
verplaatsing van vroege of late regio ; voorzie de ontbrekende regio in trans door co-introductie
van een helpervirus
vereenvoudiging door COS-cellijn : gen van T antigen genomisch  in trans voorzien bij vectoren
met uitgewisselde vroege regio
nadeel : capaciteit viraal capside : max. ~ 2.5 kb te incorporeren ;
SV40 ori op plasmiden
•
•
•
•
•
voordeel : geen grootterestrictie
enkel ori nodig  replicatie in COS cellijn ; ori + gen T-antigen  in permissieve cellen
transiënt hoge expressie - aanmaak van grote hoeveelheden recombinant eiwit : bvb. in pcDNA3.1
‘runaway’-karakter (groot aantal kopijen => grote hoeveelheden DNA) veroorzaakt celdood
!! ontwikkeling van stabiele episomale vectoren mogelijk door regulatie van T antigen expressie
(met conditionele promoter - temperatuursensitieve mutanten - e.d.)
Niet-replicerende plasmiden
•
niet-replicerende plasmiden blijven korte tijd extrachromosomaal in de cel aanwezig (lineair
DNA wordt te snel afgebroken in zoogdiercellen, dus bij voorkeur cccDNA of covalent gesloten ocDNA).
•
•
goed bruikbaar om snel met transiënte transformatie constructen uit te testen (regulatorische
gebieden aangekoppeld aan een reportergen, aanmaak van een beperkte hoeveelheid van een
nieuw recombinant eiwit (ter test, vooraleer een nieuwe stabiele cellijn te maken voor grootschalige
productie).
integratie in niet-permissieve cellen onder selectiedruk vanop het plasmide (geen co-transformatie
nodig). Diverse vectoren zijn ontwikkeld (inclusief van SV40) vooral voor expressiedoeleinden.
Transcriptie/translatie-vereisten
Aantal voorbeelden enkele slides verder
uitgebreidere beschrijving in Primrose & Twyman, Tabel 12.2)
 maximalisatie transgenexpressie
 gebruik van een sterke promoter
- Vb. adenovirale of vaccinia virus promoters
- SV40 vroege promoter + enhancer
- CMV (cytomegalovirus) vroege promoter
!!! Activiteit is afhankelijk van celtype
 aanwezigheid van een intronsequentie : bevorderlijk voor expressie
 polyadenylatiesignaal (terminatoren) - voor correct 3’ uiteinde van het mRNA
- toevoeging van > 100 adenylaat-residu’s
- vaak poly(A) van SV40 vroege transcriptie-eenheid of muis b-globine mRNA
- verhoogde stabiliteit
 3’UTR en 5’ UTR regio’s van mRNA worden best (grotendeels) weggelaten in cDNA
 optimalisatie van transgen voor expressie :
- consensus rond translatie-initiatieplaats
- codonkeuze : potentieel tekort aan preferentiële codons : codonoptimalisatie voor de
betrokken gastheer
 signaalsequentie voor secretorische pathways, bvb. Ig lichte keten
*
N
Voorbeeld van expressieconstruct in een ‘runaway’ polyoma replicon
*
N
Zie ook hoofdstuk Expressievectoren
en eiwitproductie voor nadere
beschrijving van de diverse elementen
BGH : “bovine growth hormone”
sequentie
pA : polyadenyleringssignaal
Hoog expressieniveau in COS cellen
(ORI tot 105 kopijen/cel).
 celdood ; beperkt aantal cellen
zijn getranfecteerd
neo als selectiemerker, tussen
SV40-promoter en poly(A)-signaal
• PCMV = humane CMV (cytomegalovirus) promoter
• EK = enterokinase knipplaats voor verwijdering tags
N
Ter illustratie van verdere ontwikkelingen met andere virussen
+ verder
Algemene basisaspecten en overwegingen voor en bij gebruik van
(andere) virussen voor gentransfer en expressie.
Papillomavirussen (mens, rund, …) (wratten, …)
Adenovirussen
Herpesvirussen (EBV, e.a.)
Baculovirus (bij insecten)
Retrovirussen
e.a.
Verder ook : C. elegans (Caenorhabditis elegans - nematode) als modelorganisme)
Zeer veel virussen en hun genomen werden onderzocht als mogelijkheid tot vectorontwikkeling en
klonering, in functie van hun typische karakteristieken, gastcelspectrum, specifieke toepassingen, enz…
Virussen als gentransfervectoren - transducerende vectoren
• Transductie : horizontale DNA-transfer via mechanisme van virusinfectie
• Gentransfer in vitro (celculturen) en in vivo (gentherapie toepassingen)
• Insertie van een transgen of omwisseling van virale sequenties voor een transgen
• Insertie door ligatie of homologe recombinatie
• Helper-onafhankelijk : kan zich autonoom repliceren + propageren
• Helper-afhankelijk : virale elementen moeten in trans voorzien worden
 co-infectie met helpervirus ; helperplasmide voorzien of een
‘complementaire cellijn’ (ook ‘packaging’ cellijn)
• Vaak gewenst : afwezigheid van virale coderende sequenties  enkel amplicons
overhouden (cis-elementen)
voordelen : niet-cytotoxisch en grotere inserten mogelijk
• Keuze virale vector :
afhankelijk van de te transformeren gastheer
type expressie (stabiel - transiënt)
hoeveelheid te verpakken DNA
adenovirus - retrovirus - beperkte verpakkingscapaciteit
(icosaëdrale hoofdjes)
baculovirus - staafvormig - minder strikt
Expressie :
Papilloma virussen : episomaal - structureel onstabiel
BPV – Bovine papillomavirus
• Historisch - de eerste episomale vectoren
(verre verwantschap met polyomavirussen)
• Kan muiscellen infecteren, zonder virus
te produceren
• Kopijenaantal ~100 (geen integratie)
• Ook T antigen (replicatie + oncogene
transformatie gastheercel)
(vroegste deel van infectie similair aan SV40 infectie, latere meer complex)
• Vroege functies op 69% fragment - BPV69T
• selectiemerker neo - selectie op geneticine
• Vb. expressie humaan – b-globine
• Nadeel : recombinatie - deleties - zekere vorm van instabiliteit
Papilloma virussen : human BK replicon ; episomaal - structureel onstabiel
BK virus (mens polyomavirus)
JC (of JCV) is een ander voorbeeld ;
beide hebben ongeveer 70% homologie met SV40 DNA)
• Virus dat latente infectie veroorzaakt (infecteert meerdere celtypes)
• Behoud als episomaal replicon
(geen verpakking in virions)
• Geen integratie => geen  ‘positie-effect’ (zoals bij geïntegreerde transgenen)
• Relatief laag kopijenaantal = replicon interfereert niet met gastheercelgroei
• Plasmiden met ‘latente’ ori
(geen inpakking in capsiden)
• Voordeel t.o.v. integratieve vectoren: geen integratiespecifieke beïnvloeding
van expressie
(m.a.w. geen ‘positie’-effect)
• Humaan BK polyomavirus –– kopijenaantal ~500
kan opgedreven orden tot ~ 9000 (door toenemende concentratie ‘antibiotica’
waartegen een resistentiegen aanwezig is, bvb. neoR)
• BK T-antigen kan voorzien worden in trans
Voorbeeld van een BKV vector (replicon)
BKV ori
T antigen - functies
Epstein-Barr virus gebaseerde plasmiden – stabiele expressie
• EBV : zeer stabiele replicatie in mens-cellen (+ mammalia in het algemeen)
• EBV - herpesvirus - dsDNA ~170 kb
• oorzaak van mononucleosis (‘klierkoorts’)
• episomaal replicon, ~ 1000 kopijen
• onder natuurlijke omstandigheden : alleen infectie van lymfocyten, maar na
transfectie ook in tal van andere primaatcellen te behouden
• vereist voor episomale replicatie: latente oriP en trans-werkende regulator (EBNA1)
• EBV-gebaseerde expressievectoren – 2 tot 50 kopijen per cel
• selectie : ‘neomycine’ of ‘hygromycine’ selectiemerkers - stabiele aanwezigheid
• gebruik : episomale cDNA banken
• introductie van oriP in YACs
 in vitro circularisatie  introductie in humane cellen
Epstein-Barr virus gebaseerde plasmiden – stabiele expressie
Adenovirale vectoren voor ‘kortstondige’ transiënte expressie
Adenovirus genoom
Adenovirus en adenovirus-afgeleide vectoren
• lineair, dsDNA genoom (~37 kb)
• 6 vroege transcriptie-eenheden (E) : virale replicatie
• 1 majeure late transcriptie-eenheid (MLT) : capside-eiwitten
• veel gebruikt als gentransfer- & genexpressievector & attractief voor
faagtherapie (efficiënte opname – neg./inflammatoire respons – immuunsysteem)
• voordelen: stabiliteit, hoge capaciteit vreemd DNA, hoge titer (1011 pfu/ml),
breed gastheerspectrum
• transiënte expressie in delende cellen – geen efficiënte integratie
Adenovirale vectoren:
- eerste generatie : replicatiedeficiënt : ‘E1 replacement vectors’
- kloneercapaciteit cfr. ‘uitgewisseld’ gedeelte ~7 kb
- productie in de humane embryonale niercellijn 293
die de linker 11% van het adenovirus DNA bevat
 complementatie van functies in trans
- ook andere ‘E’-regio’s verwijderd
 eventueel grotere inserties (~10 kb capaciteit)
- nadelen : virale expressie – cytotoxiciteit
eventueel recombinatie met geïntegreerde
complementerende sequenties
- enkel amplicon overhouden
- grote capaciteit (~ 37 kb)
- minimaal cytotoxisch  langere expressie
- nadeel : geen cellijn die alle functies in trans
voorziet verpakking vereist helpervirus
 risico van contaminatie
Vectorafgeleiden van het adeno-geassocieerd virus - integratief
Adeno-associated virus (AAV)
• AAV : ontdekt als contaminant in
een adenoviraal preparaat
• ssDNA virus - Parvoviridae
• AAV-genoom : ~5 kb
• rep (replicatie) en cap (capside)
genen geflankeerd door 145 nt
omgekeerde herhalingen
• van nature replicatiedeficiënt - vereist
ander virus (bvb. adenovirus,
herpesvirus) voor lytische infectiecyclus
• zonder ‘helper’ : integratie in het genoom (constante locus - chromosoom 19)
latent provirus  ‘rescue’ door o.a. een adenovirus-infectie
• noodzaak van helperinfectie = controle over virusreplicatie – veiligheid bij
gentherapietoepassing (samen met specifieke integratie)
Vectorontwikkeling :
• Rep proteïnen interfereren met endogene promoters  cytotoxisch effect
• deletie rep en cap genen  LTR enige noodzakelijke elementen voor
replicatie, transcriptie, provirale integratie (eventueel niet plaatsspecifiek in
afwezigheid van Rep-eiwitten) en ‘rescue’.
• transfectie van AAV-afgeleid construct : LTR + transgen (in plasmidevector)
+ AAV-functies (helperplasmide)
- transfectie-gebaseerd adenoviraal helperplasmide (virusvorming)
- affiniteitschromatografie voor opzuivering AAV-partikels – zoniet contaminatie
met adenoviruspartikels
• in principe beperkte capaciteit verpakking vreemd DNA - aflevering van beperkte
beperkte hoeveelheid DNA  omzeilen via co-introductie van 2 segmenten
op 2 vectoren  vectorconcatemerisatie in doelwitcel
Baculovirus-afgeleide vectoren: hoog expressieniveau in insectcellijnen
• staafvormig capside
• groot dsDNA genoom
• gastheer: insekten
• bepaalde baculovirussen : polyhedrosis virussen – productie van
‘nuclear occlusion bodies’
virions omgeven door eiwitlaag (polyhedrine) – extra bescherming
polyhedrine productie - hoog - sterke promoter
polyhedrine is niet essentieel (voor geslaagde infectie van cellijnen)
 polyhedrine-gen uit te wisselen voor een transgen
= polyhedrine ‘replacement’ vectoren
(hoog expressieniveau - 1 mg/106 cellen)
• Meest toegepast :
‘Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus’ (AcMNPV)
 eiwitexpressie in cellijnen (bvb. Sf9, Sf21)
‘Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus’ (BmNPV)
 infectie zijderups - recombinante eiwitexpressie in organisme
Baculovirus
Endocytosis van baculovirus
• ‘replacement vectors’  uitwisseling van polyhedrine-gen : screening van
recombinanten :
* Wild-type virus  productie occlusion bodies  opaque plaques
=> recombinanten  geen occlusion bodies  heldere plaques
* E. coli lacZ gen in leesraam  blauw-wit onderscheid
* ‘Green fluorescent eiwit’ (GFP) in leesraam
‘polyhedrine replacement vectors’
Opmerking bij deze illustratie
meer succesvolle systemen
werden ontwikkeld met een
grotere deletie dan enkel het
polyhedrine-gen
• Klonering door homologe recombinatie tussen polyhedrine-gedeleteerd viraal
DNA en vector met transgen en homologe regio’s
* nadeel bij beperkte deletie : lage frequentie recombinanten (0,5-5 %)
* oplossing met gelineariseerd DNA door homologe recombinatie in
een wild-type baculovirus met grote deleties (defectief); circulariteit enkel
te herstellen door homologe recombinatie met een vector waarin het
target transgen + replicon : wordt replicatie competent.
 leefbaar, recombinant genoom  tot 90% recombinanten
* bacmid : gebaseerd op elementen uit een fusie van een BAC vector met
een baculovirus (gebaseerd op plaats-specifieke transpositie) (figuur volgende slide)
• Glycosylatie :
- is mogelijk : echter : glycosylatiereactieweg verschillend tussen insecten
en zoogdieren => mogelijk onjuiste glycosylatie
 immunogeen recombinant eiwit
- oplossing : cellijnen die zoogdiereigen glycosylatie uitvoeren
of co-expressie van geschikte glycosylatie-enzymen
- vb. expressie van plasminogeenactivator (gegalactosyleerd)
=> de Sf9-cellijn brengt het 1,4-galactosyltransferase tot expressie (onder
controle van een vroege baculoviruspromoter, dus induceerbaar door baculovirus
infectie). Een baculovirus vector die een plasminogeenactivator
transgen tot expressie brengt wordt hierdoor correct geglycosyleerd.
Herpesvirus vectoren – latent – mogelijk lange termijn transgenexpressie
Herpesvirussen - groot dsDNA - o.a. EBV, HSV, Varicella zoster
• HSV-1 gebaseerde transducerende vectoren
• na transfer door transfectie – compatibel met vele cellijnen
• evenwel : via transductie - voor gentherapie - neurotopisch =
gericht naar zenuwcellen
• groot virus - transgenklonering via homologe recombinatie in getransfecteerde
cellen
• alternatief : plasmide-gebaseerde ampliconvectoren - enkel cis-elementen
(replicatie & verpakking) + verpakkingssystemen voorzien in trans
• gentransfer in vivo naar neuronen
Retrovirale vectoren – efficiënte genomische integratie
• Retrovirussen : RNA-virussen die repliceren via DNA-intermediair
• Integratie in genoom gastheercel
• Vectorontwikkeling - belangrijke kenmerken:
- sommige acuut oncogeen - replicatie-deficiënt
- geen gastheerafdoding - continue productie
- vaak sterke promoters - hoge eiwitexpressie (mogelijk induceerbaar)
- sommige breed celspectrum
- geschikt voor vectorontwikkeling door beperkte genoomgrootte
(in vitro-manipulaties eenvoudig) - hoge titers - efficiënte infectie
• Nadelen: velen – enkel efficiënte infectie van delende cellen
 beperkt qua gentherapie-toepassingen
• Lentiviridae (o.a. HIV) wel mogelijkheid van infectie van niet-delende cellen
Oncoretrovirussen - genoom
• Boven: geïntegreerd provirus – LTR
PB = primer binding sites - virale replicatie
• Onder : verpakt RNA
Geïntegreerd genoom bevat gag, pol, env genen : gag structurele eiwitten
pol reverse transcriptase
env enveloppe-eiwitten
Viraal RNA afgeschreven van promoter in linker LTR en stopt na
polyadenyleringssignaal in rechter LTR. Ook capping.
Gag-pol fusieproteïne  processing tot meerdere polypeptiden
Deel RNA splicing gag-pol en translatie env
Twee kopijen RNA genoom verpakt + reverse transcriptase & integrase