Transcript fc6. el analsis del semen humano: actualizacion del manual de la oms

CONGRESO INTERNACIONAL DE QUIMICOS
FARMACEUTICOS BIOLOGOS 2011.
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON.
Monterrey, Nuevo León a 23 de Agosto de 2011.
EL ANALISIS DE SEMEN HUMANO:
ACTUALIZACION DEL MANUAL DE LA OMS 2010.
Biol. Gerardo Cerezo Parra
Director de LABORATORIO FERTIMEXICO S.A. DE C.V.
Director de PRO-SEMEN.
Secretario General de PLEAS.
México D. F.
www.analisisdesemen.com.mx
IMPORTANCIA DEL ANALISIS DEL SEMEN.
El análisis de semen nos
proporciona información esencial
sobre el estado clínico del
individuo.
Toda alteración de la función
endocrina o exocrina del testículo
se refleja en el análisis de semen,
ya
sea
en
sus
aspectos
morfológicos y/o funcionales.
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LA CALIDAD DEL SEMEN
La calidad del eyaculado depende de la movilidad, vitalidad, concentración,
morfología y el volumen (Fluidos seminales), estos son importantes para la
función del espermatozoide y que logre la fertilización.
La calidad del eyaculado también va a depender de la forma en que se
obtenga, el lugar (Zavos y Goodpasture, 1989), la actividad sexual (Cooper et
al., 1993), la edad del paciente (Ng et al., 2004), el tamaño del testículo
(Holstein et al., 2003), estaciones del año y los días de abstinencia sexual
(Cooper et al., 1993) (Tyler et al., 1982a).
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EL SEMEN HUMANO
70%
5%
20%
lubricación
5%
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¿Cuál es el problema?
 No se ha logrado una estandarización del Análisis
de semen.
 Se han encontrado variabilidad en los resultados de
análisis de semen entre los laboratorios (Keel B.A.
et. al. 2000, Auger J. et. al. 2000, Björndahl L. 2002).
 En muchos casos existe falta de control de calidad
en los laboratorios.
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1999
Génesis del nuevo Manual 2010.
2002
Manual de Análisis Básico
2002 NAFA - ESHRE
¿Cuántas Muestras Analizar?
-Es imposible caracterizar la calidad del semen masculino al evaluar
solo 1 muestra del paciente.
-Es recomendable examinar 2 o 3 muestras para obtener datos
confiables y una media. (Carlsen et al., 2004 Castilla et al., 2006).
7
8
AREA ESPECIAL PARA COLECCION DE
LAS MUESTRAS DE SEMEN
-Área Privada y cercana al
laboratorio.
-Limitar la exposición del
semen a fluctuaciones de
temperatura.
-Darle las instrucciones
precisas al paciente:
1) Colectar la muestra
completa.
2) Comunicarnos si
perdió alguna fracción
del eyaculado.
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INSTRUCCIONES AL PACIENTE
-Abstinencia Sexual de 2-7 días.
-Aseo con agua y jabón de
genitales.
-Toma de muestra en el
laboratorio.
-Colección de muestra por
masturbación.
-No se permite el coito
interrumpido.
-No se debe perder ninguna
fracción del eyaculado.
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COLECCION DEL EYACULADO
-COLECCIÓN DE LA MUESTRA CON CONDON
ESPECIAL:
1) Incapacidad para colectar la muestra por
masturbación en el laboratorio y en casa.
2) Darle al paciente las indicaciones para la colección
de la muestra de semen con condón.
3) Utilizar condones especiales.
4) Registrar la hora de la colección del semen.
5) Entregar la muestra al laboratorio dentro de la
hora después de la colección de la muestra de semen.
6) Mantener la muestra de semen entre 20 y 37°C
durante el transporte al laboratorio.
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LICUEFACCION
Proceso en el cual el semen pasa de un estado
hiperviscoso a un estado liquido (manejable).
-El semen generalmente se licua dentro de los
primeros 15 minutos.
-El semen puede contener gránulos gelatinosos.
PARAMETRO
LICUEFACCION
VALOR DE REFERENCIA
10 – 60 MIN.
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EVALUACION DEL VOLUMEN
Transferencia al recipiente de recolección
Transferencia desde el recipiente
de recolección con pipeta o
decantando a un cilindro graduado:
• Falsos volúmenes bajos
• 0.4 a 0.8 ml (14%)
Medición indirecta a partir del peso,
asumiendo que la densidad del
semen es 1g/ml (1,014g/ml).
1)Pesar el recipiente (con la etiqueta).
2)Pesar el recipiente con el semen (g).
3)Calcular la diferencia de peso (g = ml).
Valor de referencia: >1.5 ml. Menor a esto: Hipospermia.
APARIENCIA
VALOR DE REFERENCIA:
GRIS OPALESCENTE
-Menos Opaco:
Concentración
Disminuida.
-Rojo ó Marrón:
Hemospermia.
-Amarillo:
Vitaminas.
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VISCOSIDAD
VALOR DE REFERENCIA:
VISCOSIDAD NORMAL : Se forman gotas de semen
al dejarlo caer.
VISCOSIDAD AUMENTADA:: Se forma una filancia
mayor a 2 cm.
Nota 1.- La viscosidad puede interferir con la
determinación de la movilidad, concentración,
detención de anticuerpos antiespermatozoides.
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pH
Refleja el balance entre las vesículas seminales y la próstata.
PARAMETRO
pH
VALOR DE REFERENCIA
>7.2
El pH normal del semen recién eyaculado debe ser
mayor a 7.2; Con el transcurso del tiempo el pH del
semen se alcaliniza, es por eso que es preferible
medirlo
inmediatamente
después
de
la
licuefacción (si sucede en los primeros 30
minutos), pero si sucede hasta la hora el pH es
cambiado por la perdida de CO2.
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Análisis del semen: representación de una alícuota
El semen es viscoso
Área 1: -Elevada concentración de espermatozoides.
-Espermatozoides rápidos.
-Buena morfología.
Área 2 : -Baja concentración de espermatozoides.
-Espermatozoides lentos.
-Mala morfología.
¡MEZCLAR BIEN LA MUESTRA.!
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Movilidad espermática: profundidad de la cámara
Contar a Tª ambiente o 37ºC en cámaras con una profundidad de ~20 µm, para
permitir el movimiento libre
La profundidad (D,µm) es el volumen (V, µl=mm³) dividido por el área (A, mm²)
Contar 2 x 200 espermatozoides (si es posible) en al menos 5 campos diferentes
Usar un ocular reticulado para limitar el área examinada evitando los
limites del cubreobjetos
a)
b)
> 5 mm
CATEGORIAS DE MOVILIDAD:
Movilidad Progresiva (PR): Espermatozoide con movimiento
activo; lineal o en círculos grandes independientemente de la
velocidad.
Movilidad no Progresiva (NP): Movimientos “in situ”:
Movimientos en el mismo lugar (sin desplazamiento).nado en
círculos pequeños, la fuerza del flagelo no puede desplazar a la
cabeza del espermatozoide o cuando solo el flagelo se observa.
Inmóviles (IM): Sin movimiento.
Valor de referencia: >32% PR. Menor a esto: Astenozoospermia.
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Tabla 1.- Intervalos de confianza del 95% aproximadamente para las
diferencias entre dos porcentajes determinados de conteos por duplicado de
200 (400 espermatozoides totales contados) 0 400 espermatozoides.
Aplicable para movilidad, vitalidad y morfología.
PORCENTAJE
PROMEDIO
DIFERENCIA
MAXIMA
ACEPTABLE
PORCENTAJE
PROMEDIO
DIFERENCIA
MAXIMA
ACEPTABLE
0
1
66-76
9
1
2
77-83
8
2
3
84-88
7
3-4
4
89-92
6
5-7
5
93-95
5
8-11
6
96-97
4
12-16
7
98
3
17-23
8
99
2
24-34
9
100
1
35-65
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Agregaciones: Adherencia de espermatozoides inmóviles o móviles a
células no espermáticas o detritos .
Aglutinaciones: Espermatozoides móviles adheridos a otros espermatozoides móviles.
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PRUEBA DE VIABILIDAD USANDO EOSINA-NIGROSINA
Espermatozoides con la membrana
de la cabeza intacta: exclusión de
colorantes impermeables
Ej. Eosina-nigrosina
Eosina = colorante no permeable
Nigrosina = fondo oscuro
Cabeza roja = spz muerto (D1)
Cabeza rosa = spz muerto (D2)
Cabeza blanca = spz vivo (L)
Cuello rosa = spz vivo (L)
EVALUACION DE LA VIABILIDAD
•
-Contar 200 espermatozoides (duplicado de diferentes
preparaciones) en un campo de 40X
• y obtener el porcentaje de vivos y muertos.
• Eosina Amarillenta
VIVO
MUERTO
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Concentración espermática: cámara Neubauer Improved
•Hacer duplicados de dos diluciones separadas
•No llenar ambas cámaras de una dilución
•No contar la misma cámara dos veces
•Error de muestreo
•Error de pipeteo
•Error de dilución
Cámara de 100 µl de profundidad
9 rejillas de 100nl
Rejilla central
25 cuadrados grandes de 4nl
Cada cuadrado grande
16 cuadrados pequeños de 250pl
¿Qué espermatozoides se cuentan?
Contar todos los espermatozoides
que estén dentro del cuadro central
La línea media muestra el
cuadrado relevante
: contado
: no contado
¿Qué espermatozoides se cuentan?
Se cuentan los espermatozoides sólo cuando están sobre las líneas
inferiores o izquierdas(“L”)
En la línea izquierda
En la línea inferior
: contado
: no contado
•PREPARACIÓN DEL FROTIS
•SECADO AL AIRE
•FIJACIÓN
•PAPANICOLAOU
•TREN CORTO DE TINCIÓN
(Papanicolaou modificada o DiffQuik)
•PLACAS PRETEÑIDAS
MORFOLOGIA NORMAL DE LA CABEZA
Y PIEZA MEDIA
Anormalidades
Normal
CABEZA
CUELLO Y
PIEZA MEDIA
•Grande.
•Inserción
Asimétrica.
•Amorfa.
•Cuello Doblado.
•Pequeña.
•Gruesa o
•Elongada.
Irregular.
•Piriforme.
•Fina,
•Doble.
•Gotas
•Vacuolada.
Citoplásmica,
•Acrosoma
>1/2 del área de
pequeño.
la cabeza.
COLA
•Múltiple.
•Corta.
•Doblada.
•Irregular.
•Enrollada.
DEFECTO DE CABEZA
MACROCEFALO
DEFECTO DE CABEZA
PIRIFORME
DEFECTO DE CABEZA
TAPERING
DEFECTO DE PIEZA MEDIA
PIEZA MEDIA DOBLADA
DEFECTO DE PIEZA MEDIA
GOTA CITOPLASMICA
DEFECTO DE FLAGELO
FLAGELO ENROLLADO
DEFECTO DE FLAGELO
FLAGELO CORTO
ESPERMATOZOIDE NORMAL
EVALUACIÓN DE LA MORFOLOGIA ESPERMATICA
Se valora en porcentaje de acuerdo a los
siguientes criterios:
N = Normales
DC = Defectos de cabeza.
DPM = Defectos de Pieza Media.
DF = Defectos de Flagelo.
DG = Residuo Citoplasmático
100X
N
DC DM DF
O.M.S.
2 ed.
%
>50
O.M.S.
3 ed.
O.M.S.
4 ed.
O.M.S.
5ed.
>30
>14
>4
TERATOZOOSPERMIA
<4% NORMALES
40
OTRAS CELULAS PRESENTES EN EL SEMEN
El semen contiene células diferentes de los espermatozoides como
son: células epiteliales del tracto uretral, células inmaduras (células
de la espermatogénesis) y leucocitos. A estas células se les llama
células redondas y pueden ser reportadas como número de células
por campo.
CELULAS EPITELIALES
CELULAS INMADURASY LEUCOCITOS
Mejorar los resultados de los laboratorio clínicos,
para que puedan ser transferibles.
Comprobar el grado de imprecisión de los
resultados obtenidos con los métodos analíticos
empleados en el propio laboratorio.
Comparar la inexactitud de los métodos analíticos
propios con la de otros participantes.
Apoyar el control de calidad interno.
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Análisis de Semen
Precisión(CCI) / Exactitud(CCE)
EXACTITUD
NO
SI
NO
NO
PRECISION
PRECISION
SI
SI
NO
SI
EXACTITUD
PRECISION: Dispersión de una misma muestra alrededor de su promedio.
EXACTITUD: Grado de coherencia entre el valor obtenido y el valor verdadero
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de la muestra.
PEEC EN ANALISIS DE SEMEN.
 ¿Es obligatorio participar?
-La NOM-166-SSA1-1997.Para la Organización y
Funcionamiento de los laboratorios.
9.2 Deberán participar al menos en un programa
de evaluación externa de la calidad en el cual
deberán integrar los análisis que realice y que
incluya el programa.
- La OMS(1999, 2010), Resalta la importancia de
participar en PEEC.
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PROGRAMAS MUNDIALES DE PEEC
EN ANALISIS DE SEMEN.
ESQUEMA
PAIS
Fertility Society of Australia (FSA).
Australia
United Kingdom National External
Quality Assesment Schemes
(UKNEQAS).
Reino Unido
American Association of Bioanalysts
(AAB).
Estados
Unidos
Centro de Estudios e Investigación de la España
Fertilidad (CEIFER).
College of American Pathologists (CAP). Estados
Unidos
European Society of Human
Europa
Reproduction and Embriology (ESHRE).
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1.- Viabilidad (2 muestras).
2.- Morfología (4 muestras).
3.- Concentración (4 muestras).
4.- Movilidad (4 muestras)
*European Society of Human Reproduction and Embriology.
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PEEC- SEMEN en MEXICO
Programa Mexicano de Evaluación Externa de la
Calidad en Análisis de Semen (PEEC-SEMEN).
En colaboración con:
Laboratorio de Andrología del Centro de Andrología y
Medicina Sexual, Hospital Universitario.
Karolinska, Huddinge, Estocolmo, Suecia.
Dr. Lars Björndahl
Director
LIMITES INFERIORES DE REFERENCIA
OMS´5: Valores de referencia para el semen humano
Población de referencia
Padres (parejas con un embarazo hace ≤ 12 meses
N>1600 3 continentes 5 centros
Muestra
-2-7 días de abstinencia.
-Muestras completas.
Métodos
Recolección, preparación, análisis con metodología
de la OMS
IQC + EQC – laboratorios controlados
Sólo hemocitómetro (ni CASA, ni cámara Makler)
Morfología Tygerberg
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CONCLUSIONES
Los cambios en el manual de laboratorio de la OMS para el
examen de semen humano están enfocados a:
• Aumentar la exactitud de los datos analíticos
• Suministrar más detalles experimentales de métodos
comunes.
Estos deberían ayudar a mejorar:
• La estandarización entre laboratorios.
• El valor diagnóstico de los resultados de los análisis de
semen.
• y llevar a cabo tratamientos terapéuticos.
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¡MUCHAS GRACIAS!
Biol. Gerardo Cerezo Parra
E-mail: [email protected]
Web: www.analisisdesemen.com.mx