Transcript 9. Screening van DNA banken

Activiteit
extract
CEL
proteine
aminozuursequentie
reverse translatie
Antisera
Chemische
DNA
synthesis
Tumorlijn
Natuurlijke
condition
Inductie
Sonde
Hybridisatie
mRNA
oligo-dT chromatografie
DNA sequencing
EST banken
polyA+ mRNA
in vitro translatie
cDNA
klonering
kloons
Expressie / productie
TEST
HART
HST
Activiteit
cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures
Screening
- isoleren van een gen, op basis van gekende activiteit
(eiwit gecodeerd door het gen)
- vergelijking van toestanden
(welke en hoeveel mRNA's zijn erbij betrokken?)
Screening van DNA banken
overzicht van cDNA kloneerstrategieën/werktuigen/procedures/samenspel
uitplaten van een kloonbank : als cfu/ml of pfu/ml (suspensie)
lage densiteit (individuele kloons) of hoge densiteit (tot een confluente laag)
(9 cm platen, 13 cm platen, 21 x 21 cm vierkante platen, microtiterplaten (96 - 384 - 1536)
- directe selectie : slechts zeer exceptioneel
- bvb. klonering van een antibioticum resistantiegen
- bvb. auxotrofe merkers : ‘marker rescue’ benadering : een mutante stam
of speciaal medium/conditie is vereist (vb. isolering van het trpA gen)
- bvb. ‘complementation cloning’ : met genomische DNA fragmenten van
gist kan het defect in een E. coli leuB mutant gecomplementeerd
worden => isolering van het gist LEU2 gen
- daarnaast is ook directe identificatie mogelijk : elk gen nodig voor een
biochemische conversie van een verbinding in het groeimedium tot
een visualiseerbaar product (kleur, fluorescentie, …) (vb. LacZ)
Rechtstreekse selectie van een
kloon die het R6-5 kanamycineresistentiegen (kanR) bevat.
Directe selectie van een trpA
gen met behulp van een trpAstam van E. coli
Een geschikte mutante stam moet beschikbaar zijn.
available.
Functionele complementatie
met DNA uit BAC kloons
in transgene muizen.
=> gen-gericht versus vergelijking-gericht
gen-gericht
- detectie van de gezochte kloon is gebaseerd op ‘informatie’ : dit kan
proteïne of nucleïnezuur (sequentie) zijn
- hybridisatie : sonde (probe) vereist
kolonie hybridisatie, kolonie ‘lifting’
plaque hybridisatie
probes: (in volgorde van dalende hoeveelheid informatie)
- sequentie is bekend
- homologe sequentie beschikbaar : (een fragment volstaat)
- heterologe sequentie beschikbaar : welke temperatuur?
=> ZOO blots
- aminozuursequentie van een proteïne (geheel of deels) gekend
- synthetische/gedegenereerde sondes (oligonucleotiden)
set van individuele oligonucleotiden of mengsel of ‘guessmer’
gebruik van deoxy-inosine, enz.
- screening met PCR : DNA uit kloon pools, bij positief signaal dilueren tot
uiteindelijk een homogene kloon bekomen wordt
(de sequenties waar de primers moeten aanhechten moeten
uiteraard gekend zijn ; maar ook hier kunnen mixed primers
of degenereerde primers gebruikt worden)
Screening door hybridisatie
DNA sondes
RNA sondes
oligonucleotide sondes
"mixed probes" en guessmers
"mismatch probes"
homologe sondes
heterologe sondes
=> "ZOO blots"
polyclonale antisera
monoclonale antilichamen
Kolonie hybridisatie.
De sonde ("probe") is radioactief
gemerkt of enzymatisch, fluorescent
of immunologisch geëtiketteerd ("tag").
Detectie door autoradiografie, kleur,
fluorescentie, enz.
Gelijkaardige procedures voor
plaque hybridisatie.
Heterologe hybridisatie
De aminozuursequentie van gist cytochrome c.
Het hexapeptide dat geel ingekleurd is, is een
voorbeeld van hoe een nucleotidesequentie kan
voorspeld worden vanuit een aminozuursequentie.
-trp-asp-glu-asn-asn-met-TGG-GAY-GAR-AAY-AAY-ATG2
x
2
x
2
x
18-meer
2
16 oligonucleotiden vertegenwoordigen alle mogelijkheden.
Gebruik van een synthetisch,
gemerkt of geëtiketteerd
oligonucleotide (of mengsel
van alle mogelijke sequenties) om
een kloon van het cytochroom c
gen van gist te identificeren.
=> twee hybridisatierondes :
van waarschijnlijk tot definitief.
Kodewoordgebruik
frequenties per duizend (absoluut aantal)
(hulpmiddel bij uittekenen van een
guessmer ; uiteraard de tabel
nemen van het organisme waarvan
de insert-DNAs afkomstig zijn.)
in E. coli O157:H7 EDL933
5347 CDS's (1611503 codons)
in E. coli K12
14 CDS's (5122 codons)
UUU
UUC
UUA
UUG
22.2
15.9
13.8
13.0
(35846)
(25565)
(22316)
(20904)
UCU
UCC
UCA
UCG
8.7
8.9
8.1
8.8
(14013)
(14420)
(13117)
(14220)
UAU 16.5 (26648)
UAC 12.3 (19766)
UAA 2.0 ( 3163)
UAG 0.3 ( 435)
UGU 5.2
UGC 6.4
UGA 1.1
UGG 15.3
CUU 11.4 (18366)
CUC 10.5 (16869)
CUA 3.9 ( 6257)
CUG 51.1 (82300)
CCU 7.2
CCC 5.6
CCA 8.4
CCG 22.4
(11657)
( 8961)
(13507)
(36178)
CAU 12.8 (20631)
CAC 9.4 (15116)
CAA 14.7 (23703)
CAG 29.4 (47324)
CGU 20.2 (32590)
CGC 20.8 (33547)
CGA 3.8 ( 6166)
CGG 6.2 ( 9955)
AUU 29.7 (47838)
AUC 23.9 (38504)
AUA 5.5 ( 8835)
AUG 27.2 (43846)
ACU 9.1 (14639)
ACC 22.8 (36724)
ACA 8.1 (13030)
ACG 15.0 (24122)
AAU
AAC
AAA
AAG
19.2
21.7
34.0
11.0
(30864)
(34907)
(54723)
(17729)
AGU 9.4 (15123)
AGC 16.0 (25800)
AGA 2.9 ( 4656)
AGG 1.8 ( 2915)
GUU
GUC
GUA
GUG
18.1
14.8
10.9
26.2
(29200)
(23870)
(17561)
(42261)
GCU
GCC
GCA
GCG
15.4
25.2
20.7
32.3
(24855)
(40571)
(33343)
(52091)
GAU
GAC
GAA
GAG
32.8
19.2
39.3
18.7
(52914)
(30953)
(63339)
(30158)
GGU 24.2 (38983)
GGC 28.1 (45226)
GGA 8.9 (14286)
GGG 11.8 (18947)
UUU
UUC
UUA
UUG
19.7
15.0
15.2
11.9
(101)
( 77)
( 78)
( 61)
UCU
UCC
UCA
UCG
5.7
5.5
7.8
8.0
(
(
(
(
UAU 16.8 ( 86)
UAC 14.6 ( 75)
UAA 1.8 ( 9)
UAG 0.0 ( 0)
UGU 5.9
UGC 8.0
UGA 1.0
UGG 10.7
29)
28)
40)
41)
( 8458)
(10285)
( 1751)
(24656)
( 30)
( 41)
( 5)
( 55)
CUU 11.9 ( 61)
CUC 10.5 ( 54)
CUA 5.3 ( 27)
CUG 46.9 (240)
CCU 8.4
CCC 6.4
CCA 6.6
CCG 26.7
( 43)
( 33)
( 34)
(137)
CAU
CAC
CAA
CAG
15.8
13.1
12.1
27.7
( 81)
( 67)
( 62)
(142)
CGU 21.1 (108)
CGC 26.0 (133)
CGA 4.3 ( 22)
CGG 4.1 ( 21)
AUU 30.5 (156)
AUC 18.2 ( 93)
AUA 3.7 ( 19)
AUG 24.8 (127)
ACU 8.0 ( 41)
ACC 22.8 (117)
ACA 6.4 ( 33)
ACG 11.5 ( 59)
AAU
AAC
AAA
AAG
21.9
24.4
33.2
12.1
(112)
(125)
(170)
( 62)
AGU 7.2 ( 37)
AGC 16.6 ( 85)
AGA 1.4 ( 7)
AGG 1.6 ( 8)
GUU
GUC
GUA
GUG
GCU
GCC
GCA
GCG
GAU
GAC
GAA
GAG
37.9
20.5
43.7
18.4
(194)
(105)
(224)
( 94)
GGU 21.3 (109)
GGC 33.4 (171)
GGA 9.2 ( 47)
GGG 8.6 ( 44)
16.8
11.7
11.5
26.4
( 86)
( 60)
( 59)
(135)
10.7
31.6
21.1
38.5
( 55)
(162)
(108)
(197)
Vergelijking van kodewoordgebruik in E. coli genen met hoog of laag expressieniveau
"strong" : 24 genen (5253 triplets), waaronder 12 voor ribosomale eiwitten, 7 voor buitenmembraaneiwitten
en een aantal voor RNA poluymerase en translmatie-initiatie- en terminatiefactoren.
"weak" : 18 genen (5231 triplets), voor ondermeer verschillende repressoreiwitten, lac-permease, e.a.
- immunochemische methoden : rechtstreeks op expressie product (epitoop)
(dit kan matuur proteine of fusie construct zijn)
=> binding aan polyvinylplaten (kolonies)
of aan cellulosenitraat membranen (l-plaques)
=> oorspronkelijk met
125I-gemerkte
IgG als sonde
=> nu, enzymatische merking van het antilichaam (vb. alkalische fosfatase)
primair antilichaam tegen het doelwit, secondair (gemerkt) antilichaam
om het gebonden primair antilichaam te detecteren
=> gebruik van ofwel polyklonale antilichamen of monoclonaal antilichaam
- indirecte benaderingen : louter gebaseerd op “activiteit”
(translatie in vitro tot actief eiwit)
- HArT (‘hybrid arrested translation’)
- in vitro translatie van mRNA extract
=> selectieve inhibitie van translatie door complementair DNA
- HST (HRT) (‘hybrid-selected translation’, ‘hybrid-released translation’)
- affiniteitsselectie en her-elutie van de ‘positieve’ activiteit
=> pools van clones, stapsgewijs reduceren tot enkelvoudige kloons
Antibodies :
(a) Antilichamen binden aan
"vreemde" moleculen en
helpen bij hun afbraak.
(b) Gezuiverde antilichamen
("antisera")
kunnen bekomen
worden (o.a.) uit een kleine
hoeveelheid bloed van een
konijn dat geïnjecteerd was
met het "vreemde" proteïne.
Immunoscreening
Detectie door :
- het gemerkte antilichaam zelf
of
- gemerkt proteïne A
(zoals in deze figuur)
of
- gebruik van een tweede
antilichaam dat specifiek bindt
aan het primaire antilichaam.
"Sandwich"-benadering bij
analyse met antilichamen als
sonde.
Plaque screening van kloons
van fusieproteïnen (aan LacZ)
met behulp van antilichamen.
Activiteit
extract
CEL
proteine
aminozuursequentie
reverse translatie
Antisera
Chemische
DNA
synthesis
Tumorlijn
Natuurlijke
condition
Inductie
Sonde
Hybridisatie
mRNA
oligo-dT chromatografie
DNA sequencing
EST banken
polyA+ mRNA
in vitro translatie
cDNA
klonering
kloons
Expressie / productie
TEST
HART
HST
Activiteit
cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures
Wat indien geen (enkele) informatie beschikbaar is?
Hybrid arrested translation (HArT)
mRNA extract
analyse
voeg gedenatureerd plasmide DNA
analyse
activiteit
toe van 1 of meer cDNA kloons
activiteit
in vitro translatie
proteïne
biochemische
test
in vitro translation
protein
Het plasmide DNA van de cDNA kloon die de biologische activiteit inhibeert in de
biochemische test is een goede kandidaat-positieve kloon.
Pools van DNAs worden simultaan getest, en vervolgens opgesplitst in kleinere aantallen,
totdat individuele kloon DNAs kunnen getest en geanalyseerd worden.
test
Hybrid selection translation (HST)
mRNA wordt geselecteerd uit een totaal mRNA
extract door hybridisatie op een geïmmobiliseerd
cDNA plasmide kloon DNA.
In vitro translatie van het geselecteerde mRNA
(na elutie) geeft proteïneproduct dat in de
biochemische test geanalyseerd wordt.
Positief signaal wijst naar de gewenste kloon.
vergelijking-gericht
- ‘abundance screening’ : klonering egaliseert grosso modo de hoeveelheid
DNA van de inserts in de respectievelijk cel
maar : het aantal kloons van een mRNA komt nu overeen met de
relatieve concentratie van een mRNA in de populatie
- in genoombanken : genfamilies
- in cDNA banken : hoge vs lage abundantie van mRNA’s
- differentiële expressie en ‘difference screening’ :
enkele voorbeelden
- Xenopus laevis gastrula versus egg mRNA
- vergelijking tussen blad – wortel – stam – enz. bij planten
- planten in licht of in ‘t donker
- + / - inductie
- substractieve technieken (screening/klonering)
- mRNA en cDNA zijn steeds complementair :
er is dus geen complementariteit tussen mRNA's van verschillende oorsprong
er is dus geen complementariteit tussen cDNA's van verschillende oorsprong
- sondes met positieve (na substractie) of negatieve (vergelijking) identificatie
“Abundance screening”
Hybridisatie met sondes uit een
cDNA bank om de abundante
genen (of mRNAs) te identificeren.
"Difference screening"
&
"differential expression analysis"
Meerdere DNA-filters worden in parallel gemaakt
en vergeleken na hybridisatie met verschillende
sondes.
Gemerkte of geëtiketteerde cDNA copies van
mRNA populaties van verschillende soorten
cellen of celtypes, of na groei onder diverse
condities, of na inductie of andere behandelingen.
Substractive technieken : vergelijking van celtypes
mRNA bereid uit celtype A.
mRNA bereid uit celtype B.
cDNA bereid op mRNA van celtype A,
enkelstrengig na alkalische behandeling.
Het cDNA is complementair aan het
mRNA, ook deze van celtype B voor
zover deze in celtype B tot expressie
komen.
=> renaturatie van cDNA(A) met
mRNA(B) geeft hybriden, maar
sequenties die beide celtypes niet
gemeenschappelijk hebben blijven
enkelstrengig.
mRNA en RNA-DNA hybriden binden
aan hydroxyapatiet.
Celtype A-specifiek cDNA kan worden
geïsoleerd en gebruikt hetzij om een
A-specifieke cDNA bank aan te maken,
hetzij om als sonde gebruik te worden
om een volledige cDNA bank van
celtype A te screenen.
Vergelijking van cellen voor en na inductie.
Stappen in differentiële hybridisatie screening procedures.
+/- strategie : vergelijking van
signalen bekomen met replica
filters, na hybridisatie met
materiaal afgeleid van cellen in
respectievelijk een geïnduceerd
en niet-geïnduceerd stadium.
Stippellijnen : strategie met
"gesubstracteerde" sondes,
aangerijkt in sequenties die
specifiek onder inductieomstandigheden aanwezig zijn.
Directe identificatie van de
"positieve" kloons.
vergelijking-gericht
(vervolg)
- ‘differential display’ (PCR benadering)
- cDNA-synthese start met een oligonucleotide zoals
5’-TTTTTTTTVN-3 (1 van 12)
- terugpriming met nonameren (of hexameren or decameren)
- amplicatie door “toeval” :
=> uitfiltering tot detecteerbaar aantal signalen na gelfractionatie
=> verschillen vereisen nauwkeurige bevestiging
- ESTs : random DNA sequencing van kloons uit de bank : 300-600 nt als etiket
(‘expressed sequence tag’)
- systematische sequentieanalyse van cDNA kloons (inserts)
- oriëntatie-"probleem"
- uitsortering (contig-vorming)
- voordeel : routinematig karakter ; relatieve eenvoud
- nadeel : werkintensief en duur door de grootschaligheid
enigszins overmatig t.o.v. van de gewonnen informatie
- EST-banken eerder globaal per organisme dan per conditie
"Differential display" analyse
vergelijking-gericht
(vervolg)
- RDA (‘representational difference analysis’)
- genoom vergelijking
- cDNA vergelijking
=> selectieve amplificeerbaarheid verwezenlijken van hetgeen niet
gemeenschappelijk is door manipulatie van de fragmentuiteinden.
=> 'tester' (doelwit) en 'driver' (het selecterende agens : in overmaat)
=> alleen de unieke testerfragmenten hebben een primersequentie aan beide uiteinden
- SAGE : concatemerisatie van korte etiketten (9-20 bp), één etiket per mRNA
(“serial analysis of gene expression”)
representatie van de mRNA-moleculen door een kort etiket ('tag')
=> er zijn meer dan 260.000 nonameer-etiketten
> < er zijn maximaal slechts een paar tienduizend mRNA's
- etiket => moet voldoende lang zijn om selectief (en informatief) te zijn
=> moet voldoende kort zijn om aantal sequentieanalyses
te beperken door concatenatie van de etiketten
- nadeel : heel wat manipulaties om een 'tag library' aan te maken
- voordeel : zeer kwantitatieve analyses zijn mogelijk
(tienduizenden tags zijn haalbaar ; frequentiemeting door telling)
- initëel : op basis van FokI : etiket 9 + 4
- verdere ontwikkeling naar grotere etiketten => long-SAGE
- balans tussen (meer) informatie en (meer) sequentieanalyses
RDA
uit : Primrose & Twyman
RDA : aanmaak van tester en driver DNA
Restrictiesplitsing van cDNA staal
(gemiddelde grootte van fragmenten >200 bp)
"Anneal " en ligeer een 12/24 linker cassette
(bovenste streng alleen aan linkerzijde
onderste streng alleen aan rechterzijde)
Verwijder het 12-meer en vul in tot even uiteinden
PCR amplificatie geeft een grote hoeveelheid
aan tester en driver DNA
(synthetische) linkers zijn niet gefosforyleerd
RDA
Tester
Driver
Verwijder
de
restrictiesplitsing
eerste
adaptor
door
Koppel een tweede adaptor (zoals de
eerste) maar alleen aan het tester DNA
Meng tester en driver in a 1/100 verhouding.
Denatureer en re-associeer.
Invulreactie met DNA polymerase
Tester / Driver
lineaire amplificatie
Tester / Driver
exponentiële amplificatie
Karakteriseer de
amplificatieproducten
Driver / Driver
geen amplificatie
PCR amplificatie met de primers die
overeenkomen met de tweede adaptor (of
gedeelte ervan)
Algemene basis van SAGE.
'Anchoring' enzym : NlaIII
'Tagging' enzym : FokI
(zie details op volgende slide)
Elk mRNA is vertegenwoordigd
door één tag : deze ligt, kijkend
vanaf de poly(A) staart, bij het
eerste voorkomen van een NlaIII
knipplaats.
FokI splitst op posities 9/13 : het
4-nt uiteinde wordt ingevuld
door DNA polymerase.
(het 14/18 fragment komt los van de
parels en wordt nu ingevuld tot 18-bp
even fragmenten)
Ligatie (van even uiteinden)
koppelt twee 18-bp fragmenten
tot 36-bp en splitsing met
NlaIII reduceert deze tot 18-bp
met extra 3'-CATG-uiteinden
aan beide zijden.
De tags worden paarsgewijs
geligeerd in de vector. De
paren zijn bijgevolg gescheiden
door een CATG (en kunnen
aldus geïdentificeerd worden).
Tel voor elke tag
het aantal keer
dat hij voorkomt
in de sequenties.
Voorbeeld van een SAGE tag analyse in gist (S. cerevisiae)