Transcript Ensemble de la partie A (sans commentaires à l

Technologie de l’ADN
recombinant
Gaëlle DIRIBARNE, 2008
[email protected] 1
Principe
VECTEUR
(fragment d'ADN
capable de
réplication
autonome)
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
Exemple : gène associé à
une maladie
Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant
Amplification de cet ADN, expression des protéines
correspondantes...
2
Définitions
• L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un
organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut être d'une espèce
totalement différente).
• Génie Génétique ou technologie de l’ADN recombinant : ensemble des
techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations.
Les cellules modifiées (ayant intégré un ADN recombinant) peuvent exprimer la
protéine recombinante (par exemple une protéine d’une espèce différente, une
protéine modifiée (mutée, fusionnée à une étiquette…)).
•
Le clonage désigne plusieurs choses :
- Une multiplication à l'identique (conservation parfaite de l'information
génétique) : à l’échelle cellulaire (clonage cellulaire) ou à l’échelle de
l’organisme entier (clonage reproductif).
- L’amplification d’un fragment d’ADN par des micro-organismes après
son insertion dans un vecteur
3
Plan
• A/ Les principales techniques du génie
génétique
• B/ La diversité des techniques du génie
génétique
• C/ Les applications de la technologie de
l’ADN recombinant
4
A/ Les principales techniques du
génie génétique
5
l’ADN recombinant
II) Utilisation de
I) Obtention de l’ADN recombinant
Principe de la technologie de l’ADN recombinant
VECTEUR
(fragment d'ADN
capable de
réplication
autonome)
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant
Expression et purification des protéines correspondantes,
étude du niveau d’expression et des fonctions des
protéines...
6
I) Obtention de l’ADN recombinant
1) Origine de
l’ADN de
l’organisme
donneur
2) Amplification
du fragment
d’ADN du
donneur
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
4) Insertion de l’ADN dans le
vecteur :
- Digestion
- Ligation
3) Présentation
d’un vecteur
VECTEUR
(fragment d'ADN
capable de
réplication
autonome)
Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant
5) Amplification de l’ADN recombinant obtenu
6) Vérification de la construction 7
I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
8
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
L'ADN de l'organisme donneur peut être :
- de l'ADN génomique (extrait à partir d'une culture
cellulaire...)
- de l’ADN complémentaire (ADNc) obtenu par
transcription réverse sur des ARN messagers
(L’ADNc comporte une information sur les régions 5' et 3'
non traduites, et ne contient pas d'introns)
9
Principe de la transcription réverse
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
ARNm avec queue polyA
AAAAAA
TTTTT
5’
2) Élongation de
l'amorce par la
transcriptase réverse
=> Obtention d'un brin d’ADN complémentaire
3’
1) Hybridation
avec un
oligonucléotide
complémentaire
de la queue
polyA
Pour obtenir le deuxième brin d’ADNc, une PCR est réalisée sur l’ADN obtenu
avec une ADN polymérase (voir principe diapo 12). L’ARN peut être éliminé
par un traitement la RNase.
On peut obtenir une banque d'ADNc : clonage de tous les ADNc (cela dépend
des ARNm exprimés par une cellule à un moment donné dans des conditions
données)
On peut aussi cloner un ADNc spécifique en choisissant une amorce à cheval sur
la queue polyA et le 3' du transcrit
10
I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
2) Amplification du fragment d’ADN d’intérêt
11
2) Amplification du fragment d’ADN d'intérêt :
la PCR
• Amplification du fragment d'ADN d'intérêt (gène entier ou
tronqué) par PCR : Polymerase Chain Reaction
• La PCR est une réaction de polymérisation en chaîne à partir
d'amorces spécifiques de l'ADN d'intérêt, grâce à l'action
d'une enzyme, l’ADN polymérase dans un milieu contenant
des nucléotides
12
2) Amplification du fragment d’ADN d'intérêt :
la PCR
5'T
A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C
3'
5'
Séquence à amplifier
13
2) Amplification du fragment d’ADN :
la PCR
A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
3'
3'A
T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C
5'
Température (°C)
5'T
95
72
1ère étape : dénaturation
de l'ADN à 95°C
(séparation des brins
complémentaires)
Tm
Temps
14
2) Amplification du fragment d’ADN :
la PCR
5'T
A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
3' C G C 5'
3'
Amorce
Amorce
G T C 3'
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C
Température (°C)
5’
95
5'
2ème étape : hybridation des
amorces (séquence de nucléotides
72
complémentaires de l’extrêmité de la région à
amplifier) à une température Tm
(spécifique de l'amorce)
Tm
(en général amorces de 15-25 nucléotides)
Temps
15
2) Amplification du fragment d’ADN :
la PCR
5'T
A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G
Température (°C)
T C G G A A T C C A T G C G T A C G
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C
3'
5'
3ème étape : élongation (synthèse du brin
complémentaire à partir des amorces grâce à
l’enzyme ADN polymérase et aux nucléotides
présents dans le milieu réactionnel).
Fonctionnement de l’enzyme à 72°C.
95
72
Tm
Temps
Fin du premier cycle de PCR : aucune
molécule obtenue ne correspond au produit
désiré (souligné). Un nouveau cycle de PCR
(dénaturation-hybridation-élongation)
commence.
16
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Produits du 1er cycle de PCR :
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' Brin 1
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
Brin 2
5' G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3’ Brin 3
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' Brin 4
Produits du 2ème cycle de PCR : (les amorces sont en magenta)
Produit PCR formé à 5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
partir du brin 1
Produit PCR formé à
partir du brin 2
Produit PCR formé à
partir du brin 3
Produit PCR formé à
partir du brin 4
5'G T C G G A A T C C A T G C G 3'
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5’G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'
3'C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5'G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
17
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
5'T
A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
G T C G G A A T C C A T G C G
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C
5'
3'
5'
5' G
T C G G A A T C C A T G C G T A C G
3'C A G C C T T A G G T A C G C 5'
3'
5' G
3'
Température (°C)
T C G G A A T C C A T G C G T A C G
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C
95
3'
1er cycle
5'
2ème cycle
72
Tm
Temps
Molécules obtenues à la
fin du second cycle de
PCR. Aucune ne
représente le produit
d'intérêt (souligné).
18
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Molécules d’ADN obtenues à la fin du 3ème cycle de PCR :
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5'G T C G G A A T C C A T G C G
A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
Fin du troisième cycle :
deux produits PCR
attendus apparaissent.
5' G T C G G A A T C C A T G C G
C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G T C G G A A T C C A T G C G
A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G T C G G A A T C C A T G C G
C A G C C T T A G G T A C G C 5'
Ces produits vont
ensuite se multiplier de
façon exponentielle par
rapport aux produits
non souhaités.
5' G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5'G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
19
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G T C G G A A T C C A T G C G
A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G T C G G A A T C C A T G C G
C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G T C G G A A T C C A T G C G
A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
Les deux molécules d’intérêt
obtenues au 3ème cycle donnent
chacune deux molécules d’ADN
d’intérêt au 4ème cycle.
4 fragments simple brin des
autres molécules pourront donner
un produit PCR souhaité au 4ème
cycle.
5' G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G T C G G A A T C C A T G C G
C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5' G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
Quatrième cycle de
PCR :
8 fragments d'ADN
d'intérêt
Cinquième cycle de
PCR :
22 fragments
d'intérêt
20
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
• Répétition des 3 étapes : dénaturation-hybridationélongation (la machine à PCR fait des cycles de
température) => Amplification du fragment d'intérêt de
façon exponentielle à partir du troisième cycle
• L’enzyme ADN polymérase ne doit pas être dénaturée à
95°C : utilisation de l'ADN polymérase de bactéries
thermophiles (par exemple la Taq polymérase provient de Thermophilus
aquaticus, microorganisme vivant près des sources d’eaux chaudes (50 à
80°C) ; la Pfu polymérase provient de Pyrococcus furiosus)
• Différentes enzymes peuvent être utilisées selon le degré
de fidélité souhaité pour l'amplification du fragment (la Pfu est
beaucoup plus fidèle mais plus lente pour l'amplification par exemple)
21
I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
VECTEUR
(fragment d'ADN
capable de
réplication
autonome)
Le clonage repose sur l'insertion
d'un fragment d'ADN exogène dans
un vecteur, ce qui permet ensuite
d'exprimer l'ADN dans des cellules
3) Présentation d’un vecteur
22
3) Présentation d’un vecteur de clonage
• Grande diversité des vecteurs :
(détaillée en B)
• Cosmides
• Bactériophages
• Chromosomes artificiels de levure (YAC) et de bactérie (BAC)
• Plasmides : très souvent utilisés, réplication dans les
bactéries (exemple choisi)
• Les vecteurs utilisés en génie génétique ont souvent une
origine naturelle (plasmides, bactériophages) mais ont été
largement modifiés
23
3) Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur
• Capacité de réplication autonome dans une cellule hôte
donnée
• Possession d’un site de clonage multiple pour l'insertion
du fragment d'ADN (correspond à différents sites uniques de
restriction = des sites où le vecteur peut être ouvert, voir 4))
• Insertion d'un fragment d'ADN plus ou moins grand bien
supportée
• Présence fréquente d’un marqueur de sélection (gène de
résistance à un antibiotique, marqueur de sélection
métabolique)
24
3) Présentation d’un vecteur : Exemple du plasmide
Promoteur (pour pouvoir
exprimer la protéine d'intérêt
il faut cloner la séquence
d'ADN en phase avec le
promoteur (cf. cadre de
lecture de la traduction)
Origine de
réplication
dans la
bactérie
Site de clonage multiple :
a) Vecteur
nombreux sites de restriction
(voir 4)) uniques permettant
l'insertion de l'ADN après le
promoteur
Plasmide : petite molécule
extrachromosomique, d'ADN
double brin circulaire, de 3 à 10
kilobases. Capable de se
répliquer indépendamment du
chromosome bactérien et
pouvant être transféré d'une
cellule à une autre.
Marqueur de
sélection :
résistance contre
l'antibiotique
kanamycine
25
I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR
(fragment d'ADN
capable de
réplication
autonome)
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur :
26
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Définition des enzymes de restriction
• Une enzyme de restriction est une protéine capable de
couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de
nucléotides caractéristique appelée site de restriction. C'est
une endonucléase (coupure à l'intérieur du brin d'ADN au niveau des
liaisons phosphoesters).
•
Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement
connues, dont un grand nombre se retrouve naturellement chez la
bactérie. En effet, les enzymes de restriction peuvent couper (et
ainsi conduire à la destruction) de l'ADN étranger (notamment des
virus). Cela limite les infections virales chez les bactéries, d'où le
terme de restriction. L'ADN bactérien lui-même est protégé de la
coupure par des modifications du type méthylation.
27
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Exemple d’une enzyme de restriction
Exemple : site de restriction de l'enzyme EcoRI
(provenant de la bactérie Escherichia coli)
5'
GAATTC
3'
3'
CTTAAG
5'
Rq : Certaines
enzymes donnent
des bouts francs
après coupure.
Exemple : SmaI :
CCC GGG
GGG CCC
Coupure par
EcoRI
5'
G
3'
CTTAA 5'
5'
AATTC
G
3'
Rq : Certains sites
de restriction sont
5' des séquences
palindromiques
Formation d'extrémités dites cohésives, ou bouts collants
28
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Principe
Digestion 1 heure dans le tampon adapté à
l'enzyme (cf. quantité de sels...) à la température
optimale de l'enzyme
Vecteur
(plasmide)
Site de
restriction
Enzyme 2
Site de
restriction
Enzyme1
Digestion par les enzymes 1 et 2
Création de 2 extrêmités cohésives (ou
franches) 1 et 2.
Si l’on digère le fragment d’ADN par les
deux mêmes enzymes 1 et 2, donnant des
bouts collants, on obtient des extrémités
cohésives complémentaires avec celles du
Vecteur
digéré
vecteur. Ceci permet l’insertion du fragment
d’ADN dans le vecteur.
AATT Fragment à cloner
+
Vecteur
Petit fragment d’ADN dégagé
lors de l’ouverture du plasmide
TTAA
AATT
TTAA
29
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Digestion du fragment d’ADN
Le fragment d’ADN d’intérêt ne contient pas forcément les bons sites de restriction.
Comment peut-on les ajouter aux extrêmités de l’ADN à cloner ? Cela se fait par
PCR avec des amorces spéciales :
5'T
A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G
5'
3' C G C
G T C 3'
5'
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C
3'
5'
ADN d'intérêt
Amorce avec une partie
s'hybridant sur l'ADN à amplifier et
une partie qui ne s'hybride pas
comportant la séquence d'un site
de restriction 1
Amorce avec une partie
s'hybridant sur l'ADN à amplifier et
une partie qui ne s'hybride pas
comportant la séquence d'un site
de restriction 2
30
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Digestion du fragment d’ADN
Voici l'ADN obtenu après PCR, avec les sites de restriction à
ses extrémités. Il pourra être utilisé pour le clonage.
5'
G T C G G A A T C C A T G C G
3'
3'
C A G C C T T A G G T A C G C
5'
ADN d'intérêt
Séquence du
site de
restriction de
l'enzyme 1
Séquence du
site de
restriction de
l'enzyme 2
31
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Digestion du vecteur
Vecteur
(plasmide)
Site de
restriction
Enzyme 2
Site de
restriction
Enzyme1
Digestion par les
enzymes 1 et 2
Création de 2 extrêmités
cohésives (ou franches)
1 et 2.
Le fragment d’ADN doit être cloné
dans le vecteur digéré. Le petit
fragment dégagé peut se réinsérer
Vecteur
digéré
dans le vecteur digéré à la place du
fragment d’ADN à cloner. Il est donc
nécessaire de séparer les deux
produits de la digestion du vecteur et
+
Petit fragment d’ADN dégagé
lors de l’ouverture du plasmide
de purifier le vecteur digéré pour la
suite du clonage.
32
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du
vecteur : Purification du vecteur digéré
• L’électrophorèse est une méthode de séparation des
particules chargées électriquement par migration
différentielle sous l’action d’un champ électrique. Elle
s’applique aux : protéines, peptides, acides aminés, acides
nucléiques, nucléotides
• La migration dépend de la charge et de la géométrie des
particules
• L’électrophorèse peut se faire en veine liquide ou sur un
support homogène, poreux et relativement inerte (papier,
gels…)
33
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification
du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose
Gel
d'agarose
Dépôt des échantillons
dans les puits du gel
-
Solution d'électrolyte
qui recouvre le gel
(assure la conduction
électrique)
Les fragments de restriction
sont visualisés sur gel
d'agarose par
électrophorèse :
ci-contre le dispositif utilisé
Générateur
électrique
Principe :
migration des
fragments d'ADN
dans un champ
électrique,
séparation en
fontion de leur
taille
+
34
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification
du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose
Principe de l’électrophorèse :
Fragments de restriction :
vecteur digéré et bout
dégagé par la restriction
Dépôt dans le
puits du gel
-
+
Particule
de gel
Migration des fragments
d'ADN entre les particules
de gel selon le gradient
électrique
(les acides nucléiques sont
globalement négatifs,
déplacement vers le pôle +)
Les fragments d'ADN
migrent de façon
inversement
proportionnelle à leur
taille : les plus gros
fragments migrent peu
tandis que les petits
fragments migrent
beaucoup
35
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification
du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose
Révélation du gel par
incubation avec un
intercalant d'ADN
(fluorescent)
1
2
Marqueur de poids
moléculaire : fragments de
taille connue (obtenus par
exemple après digestion
enzymatique de l'ADN du
bactériophage Lambda) =>
cela permet de déterminer la
taille des bandes d'intérêt par
comparaison au marqueur
1 : bande du vecteur digéré
2 : petit fragment extrait du vecteur lors de la digestion
Il est possible de récupérer la bande 1 : on découpe la bande sur le gel, on extrait
l'ADN de l'agarose et on le purifie sur une colonne (fixation de l'ADN sur la colonne,
lavage, puis élution de l'ADN purifié) => on récupère ainsi l'ADN du vecteur digéré,
utilisé pour le clonage.
Cette purification sur gel permet aussi d’éliminer en partie les traces de vecteur non
digéré. Si le fragment d’ADN dégagé à éliminer est très petit, une purification sur
colonne peut être suffisante.
36
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
b) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur
Fragment
d‘ADN à cloner
Vecteur
(plasmide)
Site de
restriction
Enzyme 2
Site de
restriction
Enzyme1
Vecteur
digéré
+
Petit fragment d’ADN dégagé
lors de l’ouverture du plasmide
5'
3'
3'
5'
Digestion du vecteur
et du fragment d’ADN
à cloner par les
enzymes 1 et 2
5'
3'
3'
5'
=> Création d'extrémités collantes
complémentaires. Insertion du fragment d’ADN
dans le vecteur ouvert purifié, hybridation au
niveau des extrêmités complémentaires. Il
reste à lier ces deux morceaux d’ADN de façon
covalente.
37
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
b) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur
OH 3'
P 5'
5' P
Ligase
3' 0H
• La ligase est une enzyme
capable de former des liaisons
covalentes (formation de liaisons
phosphoester) entre deux
molécules d'ADN (au niveau d'une
zone d'hybridation des molécules
d'ADN)
-0-P-P-0-
Fragment d'ADN
d’intérêt inséré dans
le vecteur
•
Intérêt d'utiliser deux enzymes
différentes lors de la digestion :
• insertion orientée de
l’ADN à cloner dans le
vecteur
• limitation de la religation
du vecteur sur lui-même
Liaison phosphoester
Après ligation, on obtient
un plasmide recombiné
38
I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR
(fragment d'ADN
capable de
réplication
autonome)
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu
39
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :
Transformation des bactéries
4) Étalement
sur boîte (pour
la sélection)
1) Mélange de plasmides
et de bactéries
compétentes sur glace
(les bactéries compétentes ont
été traitées pour faciliter l'entrée
d'ADN : leur paroi a été fragilisée
par un traitement au chlorure de
calcium)
(utilisation de Escherichia coli en
général : utilisation facile,
croissance rapide)
3) Ajout de milieu
2) Choc thermique à
nutritif aux bactéries,
42°C : les plasmides
vont pénétrer dans les croissance 1h à 37°C
(cela permet l'expression des
bactéries
protéines de résistance aux
antibiotiques pour la sélection
ultérieure)
40
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :
Sélection des bactéries transformées
Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles
comportant le plasmide recombiné)
Colonie de
bactéries
transformées
Mélange de bactéries
transformées contenant le
plasmide d'intérêt et de
bactéries non transformées
Étalement des bactéries sur une boîte contenant
un milieu gélosé et un antibiotique : seules les
bactéries transformées pourront se multiplier
car le plasmide porte un gène de résistance
contre l'antibiotique
41
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :
Extraction du plasmide recombiné
• Ensemencement d’une colonie de bactéries transformées
dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C
=> Multiplication des bactéries et donc amplification du
nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine
de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une
pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide)
• Il faut ensuite récupérer le plasmide
42
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :
Extraction du plasmide recombiné
• Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu
alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique.
L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de
l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par
centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique.
• L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double
d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un
tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des
colonnes de purification d’ADN.
43
I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR
(fragment d'ADN
capable de
réplication
autonome)
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
Les bactéries poussant sur le
Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
milieu+antibiotique
possèdent un plasmide avec
le gène de résistance à
l’antibiotique. Mais ce
plasmide contient-il l’insert
Obtention d'un ADN Recombinant amplifié
cloné ? Il peut y avoir
religation du vecteur sur luimême. Nécessité d’un crible
6 ) Vérification de la construction
pour trouver les clones
positifs ayant intégré l’ADN à
cloner.
44
6 ) Vérification de la construction
a) Vérification rapide par PCR
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné
(contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur luimême (2) => il faut distinguer ces deux populations
1
2
PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des
produits formés sur gel d'agarose
45
6 ) Vérification de la construction
a) Vérification rapide par PCR
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné
(contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur luimême (2) => il faut distinguer ces deux populations
(1)
(2)
PCR avec les amorces ayant servi à
l'obtention de l'insert, observation des
produits formés sur gel d'agarose :
Résultats du gel d’agarose :
Aucun produit détecté pour le vecteur seul (2),
mais un produit visible pour le plasmide
recombiné (1)
46
6 ) Vérification de la construction
b) Vérification rapide par restriction
Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans
l'insert et un seul site dans le vecteur :
1
2
(ex : MscI)
47
6 ) Vérification de la construction
b) Vérification rapide par restriction
1) Digestion enzymatique par une
enzyme avec un site présent dans
l'insert et un seul site dans le
vecteur puis
2) Analyse des produits de restriction
sur gel d'agarose
(1)
(2)
On obtient des cartes de restriction différentes :
une seule coupure et donc une seule bande pour le
vecteur seul (2), deux coupures et donc deux bandes
pour le plasmide recombiné (1)
48
6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
ADN de
séquence
connue
Choix d'une
amorce
ADN de
séquence
inconnue, à
séquencer
Désoxyribose :
formation
possible d'une
liaison
phosphoester
(élongation de la
chaîne
synthétisée)
5’-P-polynucléotide
Synthèse du brin
complémentaire par
une ADN polymérase
La synthèse du brin complémentaire est
faite en présence de nucléotides
désoxyribose,
P
nucléotide
5’-P-polynucléotide
Et de nucléotides didésoxyribose.
Didésoxyribose : formation d'une liaison
phosphoester impossible, blocage de
l'élongation de la chaîne synthétisée
nucléotide
P
49
6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
• Réaction de synthèse du brin complémentaire de l'ADN à
séquencer à partir d'une amorce, et en présence de nucléotides et
d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentes
tailles, dont la synthèse est bloquée au niveau du
didésoxynucléotide intégré :
ADN à séquencer
A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A
3'
5'
amorce
5'
Brins formés en
présence de
didésoxythymine (ddT)
dans le milieu
réactionnel
5'
5'
5'
5'
5'
ddT
T-A-ddT
T-A-T-C-G-ddT
T-A-T-C-G-T-A-A-ddT
T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT
T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT
50
6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
• Les didésoxynucléotides sont marqués : radioactivité ou
fluorescence.
• Analyse des différents brins formés sur gel ultra-résolutif
(détection d'une différence d'un nucléotide)
5'
5'
5'
5'
5'
5'
ddT
1
T-A-ddT
2
T-A-T-C-G-ddT
3
T-A-T-C-G-T-A-A-ddT
4
T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT 5
T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 6
6
5
4
3
2
1
51
6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
ADN à séquencer :
A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A
3'
5'
Lecture du brin complémentaire :
T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T
Une réaction de synthèse
différente pour chacun des
didésoxynucléotides, analyse
sur gel pour chaque réaction,
lecture du brin
complémentaire (en partant des
ddT
ddA
ddG
3
1
ddC
4
2
plus petits fragments vers les plus gros)
52
6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Automatisation du
séquençage
ADN à séquencer :
3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-A-G-T
Lecture du brin complémentaire :
5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-T-C-A
Automatisation des résultats de séquençage : les
didésoxynucléotides sont marqués avec des
fluorescences différentes, cela permet de faire une
seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur
détecte la fluorescence et repère la taille des fragments
d'ADN.
On obtient des courbes de fluorescences qui
sont interprétées en terme de nucléotides avec
un indice de confiance (ici barre verte :
confiance maximum)
53
II) Utilisation de l’ADN recombinant
Obtention d'un ADN Recombinant amplifié
Utilisation de l’ADN recombinant, notamment
pour comprendre le fonctionnement des gènes
Quelques exemples :
- Production et purification de la protéine étudiée en grandes quantités (pour des
analyses structurales, recherche de protéines associées, de modifications post-
traductionnelles…)
- Etude de l’expression des gènes, quantitative et qualitative ; temporellement et
spatialement
- Etude de la fonction des gènes (fabrication de protéines mutantes…)
1) Production de protéines recombinantes
54
1) Production de protéines recombinantes
a) Protocole : contraintes et solutions
• Expression des protéines dans des bactéries E. coli dépourvues
de protéases (préservation de la protéine produite)
• Les cellules sont cultivées en grandes quantités (dans des
fermenteurs pour la production de protéines à l'échelle industrielle)
• Problème : avec un fort taux de croissance et une synthèse
très importante des protéines recombinantes, les cellules
meurent rapidement, ce qui limite alors l'expression des
protéines recombinantes
• Pour résoudre ce problème : découplage entre une phase de
croissance (multiplication des bactéries, et donc amplification du
gène de la protéine d'intérêt) et une phase d'expression
(transcription du gène qui conduira à la synthèse de la protéine)
55
1) Production de protéines recombinantes
a) Protocole : contraintes et solutions
•
Une cellule hôte procaryote présente certaines contraintes :
• nécessité d'un promoteur procaryote pour que la bactérie
puisse transcrire le gène d'intérêt (il faut donc travailler avec
un vecteur adéquat)
• la bactérie ne fait pas d'épissage. Ce problème est évité
par une construction à partir d'un ADNc (comme il est obtenu à
partir d'un ARNm mature, il est dépourvu d'introns)
•
Cependant, culture facile et croissance rapide des bactéries
(contrairement aux cellules eucaryotes comme levures et ovules)
56
1) Production de protéines recombinantes
a) Protocole
0) Transformation de
bactéries compétentes par le
plasmide d'intérêt, culture à
partir des colonies obtenues
1) Culture des bactéries dans du milieu nutritif +
antibiotique nécessaire à la sélection => à 37°C,
jusqu'à une densité optique de 0,6 environ (cela
correspond à la phase exponentielle, les
bactéries sont en pleine croissance)
2) Induction de l'expression
des protéines par activation
de la trancription du gène
de la protéine
3) Récupération des
protéines
57
1) Production de protéines recombinantes
b) Contrôle transcriptionnel
La transcription du gène codant pour la protéine
d’intérêt est contrôlée à l’aide de promoteurs
inductibles :
• Promoteurs thermosensibles (changement de
l’expression suivant la température)
• Promoteur de l’opéron lactose
58
1) Production de protéines recombinantes
b) Contrôle transcriptionnel
Présentation de l’opéron lactose :
Gène régulateur
P
LacI
T
Sites de contrôle
CAP
Répresseur de l'opéron
lactose : en se fixant sur
l’opérateur, il bloque la
transcription de LacZ,
LacY et LacA
P
O
Gènes de structure
LacZ
LacY
Bétagalactosidase
(clivage du lactose
en glucose +
galactose)
P : promoteur
T : terminateur
O : opérateur
CAP : site de fixation de CAP (récepteur de
l'AMPcyclique), activateur de la transcription
LacA
T
Transacétylase
Perméase
(pompage du
lactose dans la
cellule)
59
1) Production de protéines recombinantes
b) Contrôle transcriptionnel
Fonctionnement de l'opéron lactose dans la bactérie :
1) Absence de lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Absence de transcription
P
LacI
T
CAP
P
O
Gènes de structure
LacI
2) Absence de lactose, peu de glucose dans le milieu : => Absence de transcription
P
LacI
T
CAP
CAP
P
O
Gènes de structure
LacI
3) Lactose, peu de glucose dans le milieu : => Transcription active
P
LacI
T
CAP
CAP
Analogue de
LacI
lactose
P
O
Gènes de structure
Polymérase
4) Lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Transcription basale
P
LacI
T
CAP
P
O
Gènes de structure
60
1) Production de protéines recombinantes
b) Contrôle transcriptionnel
Modification de l'opéron lactose pour les clonages :
Pour les clonages,remplacement du gène LacZ par la séquence du
gène de la protéine d'intérêt.
Utilisation d'IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), un analogue de
lactose : l'IPTG se lie avec le répresseur, l'empêchant alors de se
fixer sur l'opérateur. Cela permet l'activation de la transcription
P
LacI
T
CAP
P
O
Gène de la protéine d'intérêt
T
LacI
Transcription active
LacI IPTG
61
1) Production de protéines recombinantes
c) Extraction des protéines
Les protéines sont dans le cytoplasme des
bactéries, qui ont aussi une paroi.
Il est donc nécessaire de lyser les bactéries pour
récupérer les protéines.
Etape de sonication (destruction mécanique par
des ultrasons) et ajout d’un détergent (lyse
chimique)
62
1) Production de protéines recombinantes
d) Vérification de l’expression des protéines :
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
Prélèvement d’un échantillon
de l’extrait bactérien, supposé
contenir nos protéines
Electrophorèse sur gel de
polyacrylamide
dénaturant
Le gel de polyacrylamide est une
matrice inerte formant beaucoup de
liaisons croisées à travers lesquelles
migrent les protéines. Il joue le rôle
d'un tamis moléculaire. La taille des
pores peut être ajustée suivant la
taille des protéines que l'on souhaite
visualiser.
63
1) Production de protéines recombinantes
d) Vérification de l’expression des protéines :
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
Prélèvement d’un échantillon
de l’extrait bactérien, supposé
contenir nos protéines
Dénaturation des
protéines par mélange
avec du tampon de
charge, et chauffage
5min à 95°C
Electrophorèse sur gel de
polyacrylamide dénaturant
Le tampon de charge (Laemmli) contient
notamment :
- du glycérol qui augmente la densité de
l’échantillon et facilite son dépôt dans les puits
du gel
- un colorant, qui facilite le suivi de la migration
des échantillons sur gel
ET SURTOUT :
- des agents réducteurs : destruction des
ponts disulfures des protéines,
- un détergent anionique SDS (sodium
dodécylsulfate) : fixation sur les régions
hydrophobes de la protéine, cela provoque alors
son dépliement => la protéine est soluble dans
la solution de détergent
64
1) Production de protéines recombinantes
d) Vérification de l’expression des protéines :
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
Prélèvement d’un échantillon
de l’extrait bactérien, supposé contenir
nos protéines
Dénaturation des protéines
Electrophorèse sur gel de
polyacrylamide dénaturant
La charge intrinsèque de la protéine
est masquée par les charges négatives
du SDS. Les protéines vont donc
migrer vers le pôle positif lors de
l'application d'une tension. Les
grandes protéines, quoi que plus
chargées négativement migrent moins
loin car elles sont davantage retenues
par le maillage du gel. Les protéines
sont alors fractionnées selon leur
masse moléculaire.
Rq : Cette méthode est très puissante : elle permet d'analyser des protéines insolubles
dans l'eau, protéines membranaires, protéines de gros agrégats... Elle apporte des
65
informations sur la composition des sous-unités d'un complexe protéique.
1) Production de protéines recombinantes
d) Vérification de l’expression des protéines :
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
Gel d’acrylamide
dénaturant
Solution d'électrolyte
Dépôt des échantillons
dans les puits du gel
Plus lourd
Plus léger
Migration
des
protéines
selon leur
taille
+
Solution d'électrolyte
Electrophorèse en
conditions
dénaturantes
(destruction des
structures tertiaires et
quaternaires),
migration des
protéines
inversement
proportionnelle à
leur masse
Générateur
électrique
1) Production de protéines recombinantes
d) Vérification de l’expression des protéines :
Coloration ou transfert sur membrane
• Toutes les protéines fortement exprimées peuvent être
détectées par leur coloration dans le gel (au bleu de
Coomassie ou avec du nitrate d'argent pour des protéines
moins concentrées). C’est une détection globale de toutes
les protéines fortement exprimées.
• Des protéines en plus faibles quantités peuvent être
détectées par Western Blot après transfert sur membrane
(ex : membrane de nitrocellulose). Cette détection est
spécifique.
67
1) Production de protéines recombinantes
d) Vérification de l’expression des protéines :
Transfert sur membrane
Principe du transfert sur membrane :
Papiers buvard
imbibés de
tampon
Gel
Membrane
Papiers buvard
imbibés de
tampon
+
Générateur
électrique
Les protéines se déplacent selon le champ électrique, elles passent du gel à la
membrane. Le transfert se déroule pendant une à 2 heures.
Le même principe est utilisé pour le transfert des acides nucléiques (qui peuvent
aussi être transférés en une nuit par capillarité, en absence de champ électrique)
68
1) Production de protéines recombinantes
d) Vérification de l’expression des protéines :
Détection des protéines par Western blot
Détection des protéines sur la membrane par WESTERN BLOT :
reconnaissance spécifique de la protéine qui nous intéresse à l'aide
d'un anticorps dirigé contre cette protéine.
1) Saturation des sites non
spécifiques par incubation avec du
lait (les protéines du lait vont se fixer sur la
membrane, ce qui limite la liaison des
anticorps sur des sites non spécifiques)
Anticorps primaire
spécifique de la protéine
2) Incubation avec
l'anticorps primaire
spécifique de la protéine :
Reconnaissance de la
protéine par l'anticorps
Membrane
Protéine
d'intérêt
69
1) Production de protéines recombinantes
d) Vérification de l’expression des protéines :
Détection des protéines par Western blot
3) Lavages de la membrane
anticorps non fixés sont éliminés)
(les
Enzyme fixée
sur l'anticorps
Anticorps secondaire
spécifique du premier
anticorps
4) Incubation avec
l'anticorps secondaire,
qui reconnaît l'anticorps
primaire. Une enzyme
est fixée sur l'anticorps
secondaire
Anticorps primaire
spécifique de la protéine
Membrane
Protéine
d'intérêt
70
1) Production de protéines recombinantes
d) Vérification de l’expression des protéines :
Détection des protéines par Western blot
Substrat de l'enzyme
5) Lavages de la membrane
(les
anticorps non fixés sont éliminés)
6) Révélation du Western Blot :
le substrat de l'enzyme est
ajouté. La réaction
enzymatique transforme ce
substrat en un produit
luminescent
La réaction
enzymatique
donne un
produit
luminescent
Membrane
Protéine
d'intérêt
Marqueur de poids
moléculaire (kDa)
La lumière émise peut être détectée sur
un film photosensible, ou par une
caméra
Exemple d'image
obtenue sur film
photosensible
60
40
Signal de
notre protéine
71
1) Production de protéines recombinantes
e) Détection des acides nucléiques
Les électrophorèses sur gel d'acrylamide sont aussi utilisées pour la
séparation des acides nucléiques de petite taille ; pour des fragments
plus grands, un gel d’agarose est utilisé. La révélation se fait après
transfert sur membrane :
• Pour les ADN : on révèle les ADN sur la membrane à l'aide de
sondes ADN complémentaires marquées radioactivement (ou
chimiquement). On parle de SOUTHERN BLOT.
Le Southern Blot a été inventé par Edward M. Southern en 1975.
Cette méthode a ensuite été appliquée à d'autres molécules que les
ADN (Western Blot pour les protéines et Northern Blot pour les ARN)
• Pour les ARN : on révèle les ARN sur la membrane à l'aide de
sondes ADN complémentaires de la séquence de l'ARN étudié,
marquées radioactivement (ou chimiquement). On parle de
NORTHERN BLOT.
72
1) Production de protéines recombinantes
e) Détection des acides nucléiques
Remarque : Comment marquer une molécule d’ADN pour obtenir une
sonde ?
5’
3’
3’
5’
5’
Fragment d’ADN de restriction purifié
3’
Dénaturation et hybridation avec un mélange
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
d’oligonucléotides de 6 nucléotides
PCR avec ADN polymérase en présence de
nucléotides marqués : soit radioativement, soit
5’
chimiquement (détection avec un anticorps
5’
spécifique du groupement chimique)
Obtention de petits ADN marqués, complémentaires
de différentes zones sur les 2 brins de l’ADN
considéré
73
II) Utilisation de l’ADN recombinant
Les protéines recombinantes sont exprimées en grandes
quantités, mais sont mélangées avec les protéines
bactériennes. Il est donc nécessaire de purifier la protéine
d’intérêt.
2) Purification des protéines
74
2) Purification des protéines
a) Chromatographie
Une technique de séparation des protéines est la chromatographie. Elle
nécessite une phase stationnaire et une phase mobile, la séparation se fait en
fonction de l’affinité des protéines pour chacune des phases. Exemple d’une
chromatographie sur colonne :
1) Solutés
(mélange)
Phase
stationnaire
2) Passage
continu d’une
phase mobile
(solvant)
3) Séparation des composants de
l’échantillon suivant leur affinité pour
la phase mobile et la phase
stationnaire
75
2) Purification des protéines
a) Chromatographie
Flux de solvant
+
+- +
- Chromatographie de partage (en phase
+
inverse) : phase stationnaire apolaire et phase
+
mobile polaire. Séparation selon le degré de
+
polarité des composés.
- Chromatographie d’échange d’ions :
Molécules chargées
négativement retenues sur les
phase stationnaire chargée positivement ou
négativement. Séparation suivant la charge des billes chargées positivement
composés.
Flux de solvant
- Chromatographie d’exclusion : support
poreux. Séparation en fonction de la taille : les
grosses molécules sortent très vite de la colonne
tandis que les plus petites, qui peuvent traverser
les pores sont retardées et sortent plus tard.
- Chromatographie d’affinité : séparation
selon des propriétés de forme. C’est la technique Petites molécules retardées
par la traversée des billes
la plus puissante car elle repose sur des
poreuses ; grosses
interactions spécifiques.
molécules non retardées
76
2) Purification des protéines
b) Chromatographie d’affinité
Chromatographie d’affinité :
- Immunopurification : utilisation de l’interaction Anticorps/Ligand
Cette technique est spécifique de la protéine étudiée. Des anticorps
reconnaissant la protéine sont fixés à des billes (phase stationnaire).
Dépôt de l’extrait cellulaire sur la
colonne (phase d’accrochage sur les
anticorps)
anticorps
Protéine d’intérêt
billes
Après lavages (élimination des
molécules interagissant de façon
peu spécifique), les protéines
d’intérêt peuvent être éluées (par
exemple avec un peptide
compétiteur).
77
2) Purification des protéines
b) Chromatographie d’affinité
L’immunopurification permet de purifier une protéine spécifique, mais il faut
disposer d’un anticorps suffisamment efficace et spécifique. De plus, on n’a
pas toujours de systèmes d’élution efficaces.
On utilise aussi d’autres systèmes de chromatographie d’affinité reposant
sur des interactions ligand/récepteur du ligand et l’utilisation d’une
protéine recombinante fusionnée à une étiquette.
Protéine
d'intérêt
fusionnée à
une étiquette
Protéine
d'intérêt
Etiquette (molécule de
fusion, par exemple
peptide de fusion)
78
2) Purification des protéines
b) Chromatographie d’affinité
Protéine
d'intérêt
avec une
étiquette
Protéine
d'intérêt
Peptide de
fusion
Dépôt de l'extrait cellulaire sur
la colonne
Rétention
de la
protéine
d'intérêt
Protéines
bactériennes
Des groupements (récepteurs du
ligand) fixés sur la colonne
interagissent avec le peptide de
fusion. Toutes les autres protéines,
non retenues sur la colonne sont
éliminées.
Protéines non
retenues sur la
colonne
Lavages pour éliminer les
éventuels contaminants
79
2) Purification des protéines
b) Chromatographie d’affinité
Ajout d'un agent permettant
l'élution (un compétiteur)
Après élution on obtient les protéines d'intérêt
fusionnées.
Un clivage peut être effectué entre la protéine
d'intérêt et le peptide de fusion. Un nouveau
passage sur colonne d'affinité permet de
retenir les peptides de fusion et de récupérer
les protéines purifiées
Clivage
spécifique
Protéines d'intérêt
éluées
Rétention
de la
protéine de
fusion sur la
colonne
Protéine
d'intérêt
purifiée
80
Conclusion : Utilisation des protéines recombinantes :
- Avec de grandes quantités de protéine purifiée, possibilité d’analyser la
structure 3D par diffraction des rayons X ; possibilité d’analyser les
modifications post-traductionnelles de la protéine au spectromètre de
masse
- Possibilité de co-purifier des protéines associées à la protéine
étudiée si les lavages ne sont pas trop stringents
Protéines
associées
Protéine d’intérêt
Anticorps
Séparation des protéines sur gel ;
études par Western blot pour des
protéines connues ou par spectromètre
de masse pour des molécules
inconnues
Billes
La protéine est digérée pour obtenir un ensemble de peptides. Dans le spectromètre
de masse, les peptides sont fragmentés, et la masse des fragments obtenus est
mesurée. L’ensemble des masses des différents fragments est caractéristique d’une
molécule donnée. Cette technique permet d’identifier des molécules, mais aussi de
détecter des modifications sur une protéine connue
81
II) Utilisation de l’ADN recombinant
Différents types cellulaires sont caractérisés par l’expression de protéines
différentes.
L’expression différente des gènes (codant notamment pour des protéines
homéotiques) dans un embryon joue un rôle clé dans la mise en place du
plan d’organisation de l’organisme.
Suivant les conditions, les besoins en différentes protéines changent
(exemple du stress).
Comment étudier l’expression des gènes, à la fois d’un point de vue
quantitatif et qualitatif, et d’un point de vue spatial et temporel ?
3) Etude de l’expression des gènes
82
3) Etude de l’expression des gènes
a) Quantification des protéines dans un extrait cellulaire
- Par Western blot : pas de quantification absolue. On peut
obtenir des données comparatives qualitatives entre
différentes conditions. Un gène de ménage est souvent utilisé
comme référence.
- Par dosage : méthodes spectroscopiques, immunologiques,
enzymatiques
- Indirectement par Northern blot : information sur la quantité
d’ARN messager correspondant à la protéine (Rq : une
augmentation des ARNm peut provenir d'une augmentation de la
transcription ou d'une augmentation de la stabilité des ARNm). Le
Northern blot fournit des informations plus quantitatives qu’un
Western blot (moins de problème de saturation du signal)
83
3) Etude de l’expression des gènes :
b) Les gènes rapporteurs
Le niveau d’expression d’un gène peut être quantifié à l’aide de gènes
rapporteurs : remplacement de la portion codante du gène considéré par un gène
rapporteur :
- gène d'une enzyme (mesure enzymatique)
- gène d'une protéine fluorescente (mesure de la fluorescence)
Exemple : Remplacement de la séquence codante du gène étudié par la séquence
codante d’une enzyme : la luciférase.
Séquence
Séquences
codante du
promotrices
gène d’intérêt
luciférine
(substrat de
l'enzyme)
Luciférase
Séquence
de la
luciférase
Réaction enzymatique
=> Emission d'un
photon (quantification
possible par
spectrophotométrie)
Mesure de l'activité
enzymatique in vitro avec
ajout du substrat. Ce sont
des données relatives, qui
doivent être comparées à
une référence.
84
3) Etude de l’expression des gènes :
b) Les gènes rapporteurs
Activité luciférase
Exemple : niveau
d’expression d’un gène X
sous deux conditions
différentes (1et 2)
On obtient des informations
sur le niveau d’expression
d’un gène dans une cellule à
un moment donné, pour des
conditions données (résultats
quantitatifs contrairement au
Western blot)
1
2
Gène X quatre fois plus exprimé dans
la condition 1 que dans la condition 2
85
3) Etude de l’expression des gènes :
b) Les gènes rapporteurs
Ce genre de construction permet également d’analyser ce qui
contrôle l’expression des protéines : Exemple :
1
2
Séquence codante du gène X
Cellules
A B C D
Séquence codante du gène rapporteur
Séquences promotrices
La séquence régulatrice 1 active l’expression du gène X dans la
cellule A, la séquence 2 active l’expression de X dans la cellule C
86
3) Etude de l’expression des gènes :
b) Les gènes rapporteurs
Il est possible d’obtenir des animaux transgéniques exprimant les
séquences promotrices d’un gène étudié fusionné à un gène
rapporteur.
Exemple :
Stade 1 : pas
d’expression du
gène
Stade 2 :
expression
postérieure du
gène
La révélation du produit du gène rapporteur sur des embryons à
différents stades apporte des informations spatiales et
temporelles sur l’expression du gène étudié.
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3) Etude de l’expression des gènes :
c) Localisation des protéines
Comment localiser notre protéine dans des cellules ?
Deux possibilités :
1) Regarder la protéine endogène par immunofluorescence
2) Construire une protéine fusionnée à une protéine fluorescente
Dans les 2 cas, l'observation est faite avec un microscope à
fluorescence. On peut regarder la localisation de la protéine d'intérêt
dans des cellules en culture ou des coupes de tissus. Dans tous les
cas, les cellules sont préalablement fixées (elles sont alors
immobilisées et les macromolécules sont stabilisées et bloquées en
l'état).
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3) Etude de l’expression des gènes :
c) Localisation des protéines : immunofluorescence
Pour localiser des protéines endogènes dans une cellule (ou sur une coupe de
tissu), une technique proche du Western blot est utilisée : l'immunofluorescence
Cellule
fixée sur lamelle et
perméabilisée
protéine
étudiée
lavages
noyau
Détection de la protéine par un
anticorps spécifique (anticorps
primaire) après incubation avec de
la BSA (bovine serum albumine,
pour saturer les sites de liaison non
spécifiques)
lavages
noyau
Analyse du signal
fluorescent par
observation au
microscope à
fluorescence
=> localisation de
la protéine d'intérêt
Reconnaissance de
l'anticorps primaire par un
anticorps secondaire
fusionné à un fluorophore
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3) Etude de l’expression des gènes :
c) Localisation des protéines : fusion à une protéine
fluorescente
On peut fusionner une protéine fluorescente à l'extrêmité C-terminale ou Nterminale de la protéine d'intérêt. Des plasmides contenant les protéines
fluorescentes existent, et contiennent des sites de restriction permettant de
cloner la protéine d'intérêt.
Ex : fusion à la GFP (Green Fluorescent Protein). La GFP est une protéine issue
d'une méduse Aequorea victoria, capable d'émettre une fluorescence verte après
excitation par une lumière bleue.
Excitation
par lumière
bleue
GFP
protéine
d'intérêt
Emission de
fluorescence
verte
Localisation des protéines dans
une cellule par observation au
microscope à fluorescence
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3) Etude de l’expression des gènes :
d) Localisation des ARN et ADN
Les ARN et ADN peuvent être localisés dans une cellule ou une coupe de
tissus grâce à l'hybridation in situ (FISH en anglais, pour Fluorescent in
situ hybridization) : Utilisation d'une sonde fluorescente d'ADN
complémentaire de l'ARN ou ADN étudié et visualisation sur un
microscope à fluorescence.
Pour l'ADN chromosomique : les chromosomes sont préalablement
exposés à un fort pH ce qui détruit les appariements de bases de l'ADN.
La sonde complémentaire de la région étudiée a alors accès à l'ADN.
Pour l'ARN : pas d'exposition à un fort pH pour que l'ADN reste
bicaténaire et ne fixe pas la sonde. Fixation douce pour que l'ARN soit
conservé dans une forme exposée.
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3) Etude de l’expression des gènes :
d) Localisation des ARN par Hybridation
Fluorescente In Situ (FISH)
Les sondes utilisées sont souvent de l'ADN. Elles sont fluorescentes.
Autrefois les sondes étaient marquées radioactivement. On peut
également trouvé des sondes avec un marquage chimique, détecté
ensuite par des anticorps.
Protocole : les sondes sont dénaturées. Elles sont incubées avec les
cellules fixées et perméabilisées en présence d'ARNt et de BSA pour
saturer les sites non spécifiques. Des lavages permettent d'éliminer les
sondes non fixées, avant l'observation microscopique.
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Conclusion : Etude de l’expression des gènes :
Les analyses se font de plus en plus à une échelle globale.
Exemple : les puces à ADN permettent de comparer l’ensemble des
ARNm présents dans 2 échantillons différents :
Collection de molécules d’ADN, spécifiques de gènes,
ampifiées par PCR , puis fixées sur une lame de verre
ARNm issus de l’échantillon
ARNm issus de l’échantillon
1 marqués par un
2 marqués par un
fluorochrome rouge
fluorochrome vert
Hybridation sur la lame, lavages, et
analyse des signaux fluorescents
Les spots rouges correspondent à des gènes beaucoup
plus exprimés dans l’échantillon 1 que dans l’échantillon 2
Les spots verts correspondent à des gènes beaucoup plus
exprimés dans l’échantillon 2 que dans l’échantillon 1
Les spots jaunes correspondent à des gènes exprimés de
la même façon dans les deux échantillons et les spots noirs
à des gènes non exprimés dans les deux échantillons
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II) Utilisation de l’ADN recombinant
Approche génétique classique : point de départ, des
mutants avec un phénotype intéressant ; puis recherche
des gènes impliqués
Approche génétique inverse : développée grâce à la
technologie de l’ADN recombinant ; il est possible de
cibler une mutation dans une séquence donnée.
Cette version mutante peut être transférée dans une
cellule pour son étude (voir partie B).
4) Etude de la fonction des gènes/protéines
94
4) Etude de la fonction des gènes/protéines
a) Approche génétique classique
Mutagenèse aléatoire :
par insertion (d’un
transposon…),
chimique…
Crible pour
identifier un
phénotype
intéressant
Recherche
du/des gènes
impliqués
- Test de complémentation entre mutants
pour savoir si ce sont ou non les mêmes
gènes impliqués
- Localisation du gène impliqué :
- Séquençage autour de l’insertion
après avoir récupéré le fragment
correspondant
- Test de liaison (position relative
par rapport à d’autres gènes
connus ou séquences particulières)
- Recherche d’homologies de séquence ;
étude de l’expression du gène spatiale et
temporelle
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4) Etude de la fonction des gènes/protéines
b) Approche génétique inverse
Comment est obtenue une version mutée d’un gène ?
- Par PCR mutagène (PCR en présence d’un déséquilibre entre les différents
nucléotides et d’un tampon différent) => mutations aléatoires dans la séquence
- Par mutagenèse dirigée : PCR avec des amorces particulières => insertion d’une
mutation à un endroit précis (exemple : modification d’un acide aminé particulier)
amorces utilisées
pour la PCR
ADN matrice à
muter :
le plasmide entier
avec la séquence
du gène d’intérêt à
muter
Zone de mésappariement de
l'amorce avec la matrice,
correspondant à la mutation à
introduire
Exemple : Séquence à muter :
cag cgc gat ttc
Q
R
D
F =>
remplacement de l'aspartate
par une alanine :
Séquence de l'amorce:
cag cgc gCC ttc
Q
R
A
F
On fait une PCR sur un
plasmide entier avec des
amorces présentant un
mésappariement (mutation à
introduire) avec la matrice
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4) Etude de la fonction des gènes/protéines
b) Approche génétique inverse
A la fin de la PCR de la mutagenèse dirigée on se retrouve avec un mélange de
plasmides initiaux sans la mutation et de plasmides contenant la mutation
plasmide
initial
Le plasmide initial est méthylé car il a été amplifié
dans une bactérie (méthylation de séquences
d'ADN spécifiques).
Afin de sélectionner les plasmides avec la
mutation, traitement par une enzyme qui coupe
plasmide
avec la
mutation
des séquences d’ADN particulières seulement
si elles sont méthylées, puis transformation
dans des bactéries. Seul le plasmide muté, non
digéré, pourra se répliquer dans les bactéries.
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4) Etude de la fonction des gènes/protéines
b) Approche génétique inverse : différents
types de mutants
- Mutation avec gain de fonction : souvent liée à la surexpression
du gène (le gène peut être placé sous le contrôle d’un promoteur
puissant, et sur un plasmide multicopies)
- Inactivation de gène (knockouts)
- Mutation effet dominant négatif :
Pour une protéine entrant dans la formation d’un complexe, une
mutation peut conduire au dysfonctionnement total de ces protéines, y
compris des protéines non mutantes :
4 protéines associées
en complexe,
protéines actives
4 protéines mutantes
associées en
complexe, protéines
inactives
1 protéine mutante
dans le complexe,
toutes les protéines
sont inactivées
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4) Etude de la fonction des gènes/protéines
b) Approche génétique inverse : utilisation
des mutants
- Etude des phénotypes des mutants
- Complémentation fonctionnelle :
(expériences sur des mutants conditionnels)
Levures thermosensibles
mutantes pour un gène X
Banque d’ADNc d’un autre organisme
eucaryote, dans un vecteur levure, avec
un marqueur de sélection
Transformation des levures, étalement sur milieu sélectif à température
permissive (la mutation du gène X ne s’exprime pas)
Incubation à température permissive :
toutes les cellules se développent
Incubation à température non permissive (la
mutation du gène X s’exprime) : seules les
cellules ayant une protéine qui complémente le
défaut de X poussent
Si restauration de la fonction X : complémentation
fonctionnelle (identification d’un gène équivalent à
celui muté chez la levure dans un autre organisme)
Rq : ce test peut aussi mettre en
évidence des gènes suppresseurs
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II) Utilisation de l’ADN recombinant :
Conclusion
A partir de la séquence partielle en acides aminés,
synthèse d’une sonde ADN, hybridation sur banque
d’ADN génomique ou ADNc
Protéine
Gène ou ADNc
Clonage dans un vecteur d’expression
Production et purification de protéine recombinante
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