Transcript IDB HC 8 Eiwitzuivering 4

Eiwitzuivering 4
Een praktijkvoorbeeld
Specifieke en totale activiteit
Recovery en zuiveringsfactor
Wat te doen met eiwitten?
TBEMH-P05IDB HC8
Sigrid Beiboer
Voorbeeld eiwitzuivering
Strategie eiwitzuivering, een voorbeeld
Inventarisatie van beschikbare gegevens:







ppPLA2: porcine pancreatic phospholipase A2
Gekloneerd in Escherichia coli als pro-enzym (proPLA2)
DNA en aminozuursequentie van proPLA2 is bekend
◦ Mature enzym: 124 aminozuren, 14 kDa
◦ Prosequentie: 7 aminozuren
pI bekend: 6,3
Stabiel eiwit (7 zwavelbruggen): goed resistent tegen
bevriezen, ontdooien, bewaren bij KT en pH 4-9
Kristalstructuur is bekend
Enzymatische activiteit is bekend
Structuur van PLA2
Enzymatische activiteit van PLA2
Schema eiwitzuivering van PLA2 uit E.coli
bacteriecellen
Homogenisatie + centrifugatie
PLA2 in eiwitmengsel
Centrifugatie
Ionchromatografie (bij pH 4)
Dialyse
Ionchromatografie (bij pH 6)
Dialyse
FPLC
+ eiwitten
Homogenisatie
10 L Kweek medium
met bacteriecellen
Triton X-100 toevoegen
tot 0,1% eindconcentratie
Centrifugeren
Sonificatie (3*1 min op ijs)
Bacteriecellen in 300 ml TE buffer
(pH 8) + 75 gr. sucrose
Resuspenderen
60 mg lysozym toevoegen
Mengen, 30 min op ijs
300 ml TE buffer toevoegen
Centrifugeren
Pellet resuspenderen
in 400 ml TE buffer
Sonificatie (1 min op ijs)
Centrifugeren
Mengen, 30 min op ijs
Pellet met inclusion bodies
Sonificeren in 100 ml porties (3*90 sec op ijs)
Hervouwing van proPLA2
•
7 M guanidine: pellet met inclusion bodies lost op
•
Thannhauser reagens sulfoneert eiwit (S-SO3-)
•
IJsazijn precipiteert eiwit
•
Centrifugatie en wassen van eiwit met water (2x)
•
8 M ureum: gesulfoneerd eiwit lost op
•
4 x verdunnen met buffer met cystine en cysteine:
- 2 M ureum eindconcentratie,
- hervouwing (o/n, 4ºC)
- vorming juiste zwavelbruggen
•
Gerenatureerd proPLA2
Activatie van PLA2
•
CaCl2: PLA2 heeft Ca2+ nodig voor enzymactiviteit
•
pH instellen (8,3)
•
Trypsine: 5% (w/w) eindconcentratie (hoeveelheid
proPLA2 geschat met SDS-PAGE)
•
Trypsine knipt prosequentie eraf en activeert PLA2
•
PLA2 enzymactiviteit volgen met enzymbepaling
•
Geen toename enzym activiteit:
◦
- pH naar 4,5 met ijsazijn
◦
- trypsine inactief bij pH 4,5
Activatie van PLA2 volgen met bepaling
van enzymactiviteit
t=1
t=2
t=3
t=4
Enzymactiviteit
Vrijgekomen vetzuur titreren met loog
Actief PLA2
Tijd (min.)
Zuivering van PLA2 met ionchromatografie
•
•
•
•
Centrifugatie: verwijdering van geprecipiteerd eiwit
SP-Sephadex C25 bij pH 4
- kolom wassen met 4 kolom volumes NaAc
- elutie PLA2 met zoutgradiënt (0 – 0,8 M NaCl)
Dialyse tegen 5 mM azijnzuur
CM-Cellulose bij pH 6 (elutie met 0 – 0,4 M NaCl)
Zuivering met kolom chromatografie
Fractieverzamelaar:
-
meet OD280 en geeft dit door aan recorder
verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en geeft
buiswisseling ook door aan recorder
-
Eiwitoplossing in
deze 2 buizen
wordt verzameld
en gedialyseerd
OD280
Loog (mmol)
Activiteit
mmol loog
in 3 min
t=0
t = 3 min
Tijd (min.)
Stel, 20 ml zuiver PLA2 van 0,117 mg/ml (20 * 0,117 = 2,34 mg PLA2)
Enzymbepaling met 300 l geeft 4,05 mol loog/min = 4,05 I.U.
4,05 / 0,3 = 13,5 I.U./ml
Specifieke activiteit (S.A.): 13,5 / 0,117 = 115 I.U./mg
Totale activiteit:
20 * 13,5 = 270 I.U.
Internationale Units (IU)
Definitie:
1 IU is die hoeveelheid enzym die in staat is
om 1 mol/min substraat om te zetten of
product kan vormen onder omschreven
condities (pH, T, substraat, buffer)
Vraag:
Waarom IU en geen mol/l?
Als je een enzymbepaling doet, dan
Moet [S].....?
 Moet de pH.....?
 Moet de temperatuur.........?

Als je een enzymreactie spectrometrisch
wilt volgen, dan
a)
b)
c)
d)
Moet het substraat absorberen
Moet het product absorberen
Moeten het substraat en het product
absorberen
Mogen het substraat en het product niet
absorberen
Vb. kwantificering zuiver ppPLA2
Spectrofotometrisch OD280
 Meten tussen OD280 0,1 en 1 en blanco stellen met
buffer
 Tryptofaan, Tyrosine en in mindere mate
phenylalanine en alle zwavelbruggen
 1 Trp 1*0,4 = 0,4
 8 Tyr 8*0,1 = 0,8
 5 Phe + 7 S-S = 0,1
 E1mg/ml
1,3
 OD280 = 0,78  0,78/1,3 = 0,60 mg/ml

Zuivering en recovery
•
Recovery of yield: totale activiteit na bepaalde stap
gedeeld door totale activiteit voor zuivering
•
Zuiveringsfactor: specifieke activiteit na bepaalde stap
gedeeld door specifieke activiteit voor zuivering
Per stap
Totaal (begin – einde zuivering):
Recovery (%)
Zuiveringsfactor
100
1
96
3,2
83
6,25
75
3
75
25
- recovery = 45%
- zuivering = 1500
En wat is de totale recovery na de eerste 3 zuiveringsstappen?
Karakterisatie
•
Aminozuur sequentie
•
Drie dimensionale structuur : NMR, X-ray kristallografie
•
Massaspectrometrie
•
Stabiliteit (PLA2: toename tyrosine signaal bij hogere
guanidine-HCl concentraties)
•
Biologische activiteit:
- affiniteit
- enzymactiviteit
Ca2+ affiniteit van PLA2
KCa2+ (mM)
S.A. (U/mg)
WT ( )
12,4
0,9
Mut ( )
1,6
1,6
pH optimum van PLA2
PLA2
Mut
pI
6,3
5,6
TAA is een onnatuurlijk aminozuur:
- Lijkt erg op histidine
- pKa (TAA) is 4 eenheden lager dan pKa (His)
TAA: 1,2,4-triazole-3-alanine
Interface activering van PLA2
Micelvorming:
- voldoende substraat
- detergens toevoegen
Massaspectrometrie






Ionisatie moleculen in gasfase
Versnelling ionen in elektrisch veld
Scheiding ionen op basis van hun massa/ladingsverhouding
Detectie
Snel (steeds meer gebruikt, mn ziekenhuizen)
Nauwkeurig (dalton)
Bepaling van de ruimtelijke structuur
NMR
 X-ray kristallografie
 Modelling: homologie
(sequentie of functie
domein) zoeken met
eiwitten van bekende
structuur

Lysozyme
Lactalbumin
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Spectroscopy



Atoomkernen van sommige isotopen
hebben magnetische momenten
Deze is afhankelijk van omgeving
Gebruik: - eiwitstructuur bepaling
- volgen metabolisme
(ziekenhuizen)
X-ray kristallografie
Protein engineering
Protein engineering bij Genencor, Leiden
Beste eigenschappen van 2 soortgelijke eiwitten combineren
Voorbeeld: alpha amylases met verhoogde stabiliteit, veranderde calciumbindende eigenschappen en verbeterde werking bij lage pH.
Proteomics in drug discovery
Biochemistry vs. Proteomics