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Etude de la mobilité des éléments
intégratifs conjugatifs (ICE) intégrés dans
un gène codant un ARNt Lysine chez
Streptococcus agalactiae
Présenté par Aurore PUYMEGE
Encadrée par : Sophie PAYOT-LACROIX
Gérard GUEDON
LABORATOIRE DE GENETIQUE ET
MICROBIOLOGIE
UMR1128 INRA, Nancy-Université - IFR 110
Introduction
Transfert horizontal
● Rôle clé dans l’évolution
des génomes bactériens et dans
l’adaptation aux changements
environnementaux
● Transfert intercellulaire de
l’ADN par :
- transduction
- transformation
- conjugaison
● Transfert inter ou intra
cellulaire de l’ADN par les
éléments génétiques mobiles
Introduction
Eléments intégratifs conjugatifs ou ICE
Réceptrice
Donatrice
attI
attI
attR
attB
attB
attL
attR
attL
attR
attL
attL
attR
Pavlovic et coll., Microbiology, 2004
Introduction
Streptococcus agalactiae
 Bactérie appartenant au phylum des Firmicutes
 Streptocoque de groupe B (GBS)
 Aérobie-anaérobie facultatif
 Environ 30% de la population est porteur asymptomatique
 Bactérie pathogène chez : - les nouveaux-nés
- les personnes âgées
- les personnes immunodéprimées
- les bovins
méningites
pneumonies
septicémies
mammites
Introduction
ICE et éléments en dérivant chez Streptococcus agalactiae
● Etude sur les 8 génomes
totalement
ou
partiellement
séquencées
● Mise en évidence in silico de :
- 12 ICE putatifs
- 19 éléments en dérivant
● 15 sites d’intégration
 Grande diversité de
éléments chez S. agalactiae
ces
Brochet et coll., J. Bacteriol., 2008
Les éléments intégrés à l’extrémité 3’ de l’ARNtLys
Introduction
● Grande diversité des éléments intégrés dans ce locus
● Présence de nombreux gènes pouvant être impliqués dans la réponse aux stress et
la virulence de S. agalactiae
Objectifs
Objectifs
Etude de la fonctionnalité des 4 ICE putatifs intégrés
à l’ARNtLys chez S. agalactiae
- Est-ce que les quatre éléments sont capables de s’exciser ?
- Est-ce que les éléments sont capables de se transférer ?
Résultats
2
3
attR ARNt Lys
attL
COH1
1
18RS21
2603 V/R
515
100 pb ladder
Test d’excision des ICE
ICE
Excision
attB ARNt Lys
+
attI
1,5 kb
547 pb
1 kb
700 pb
500 pb
300 pb
200 pb
100 pb
400 pb
597 pb
492 pb
404 pb
Seul l’élément présent chez la souche 515 s’excise
Résultats
Test d’excision des ICE
attI
attR ARNt Lys
1
2
3
COH1
2603 V/R
18RS21
ICE
515
100 pb ladder
attL
Excision 1Excision 3
Excision 2
attR’ARNt Lys
attB ARNt Lys attL attL
attR ARNt Lys
’
315 pb
+
+
1,5 kb
500 pb
300 pb
200 pb
100 pb
+
attI
1 kb
700 pb
214 pb
547 pb
597 pb
492 pb
404 pb
attI’
attI’
’’
attI’
’
492 pb
597 pb
404 pb
● Deux formes circulaires d’ICE_2603_tRNALys
sont détectables
Résultats
Test de transfert conjugatif
● Souche donatrice :
515 EryR
attI
● Souche réceptrice :
Nem316 RifR StrR
COH1 RifR StrR
A909 RifR StrR
attI
attR
attL
ARNt Lys
attB
ARNt Lys
● ICE_515_tRNALys se transfère à une fréquence maximale de 4x10-7 (+/0,9 x10-8) transconjugants / cellule donatrice dans les conditions testées
Résultats
Test de transfert conjugatif
● Blocage du contact entre cellules donatrices et réceptrices
Donatrice
et réceptrice
 Transconjugants
Donatrice
Réceptrice
 Aucun transconjugant n’est
observé
 Pas de transconjugant
Fréquence de transfert
3.00E-07
● Ajout de DNase I dans le milieu
2.50E-07
2.00E-07
 Les fréquences de transfert sont
identiques avec et sans DNase I
1.50E-07
Dnase +
Dnase -
1.00E-07
5.00E-08
0.00E+00
 Ces témoins excluent l’hypothèse d’un mécanisme de transformation
Discussion
Conclusions
DONATRICE
RECEPTRICE
Nem316
515
COH1
A909
2603V/R
COH1
18RS21
Nem316
Discussion
Discussion
● Pas d’excision d’ICE_COH1_tRNALys et ICE_18RS21_tRNALys (et donc
de transfert) :
- fréquence d’excision trop faible pour être détectée ou perte
de la forme circulaire
- régulation différente
● Pas de transfert d’ICE_2603_tRNALys :
- fréquence de conjugaison trop faible pour être détectée
- interruption d’un gène du module de conjugaison (orfD)
● Fréquence de conjugaison différente selon la souche réceptrice utilisée
Discussion
Perspectives
● Vérification de la spécificité d’intégration d’ ICE_515_tRNALys
● Caractérisation de la machinerie de conjugaison utilisée par ces
éléments génétiques mobiles
 Etude de la relaxase
- rôle de la relaxase dans la régulation des gènes
de l’élément
- caractérisation du site reconnu par la relaxase,
de sa spécificité et de ses partenaire(s) protéique(s) (relaxosome)