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UE Spécifique
ANALYSE ET METHODES D’ ETUDE
DU GENOME
I- STRUCTURE DU GENOME
•
•
•
•
Organisation
Composition
Les différentes séquences
Le gène
INTRODUCTION
• Ensemble du matériel génétique d’un
organisme
• Il est constitué d’ADN pour la majorité des
organismes
• Certains virus ont un génome constitué
d‘ARN
• La taille du génome varie en fonction des
espèces
ORGANISATION
• Chez la majorité des bactéries ( procaryotes)
le génome est contenu dans UN seul
chromosome circulaire
• Le génome peut être linéaire (actinomycètes)
• Chez les eucaryotes : ADN nucléaire , ADN
mitochondrial
DENSITE DES GENOMES
• Chez E.Coli , le génome est composé presque
exclusivement de gènes
• 4.6 Mégabases / 4000 Gènes / soit 950/MGb
• Chez l’Homme
• 3200 Mégabases / 25000 Gènes / 8 / MGB
• La quasi-totalité génome bactérien est codant !
Espèce Humaine
• Génome nucléaire: 3,2 109 pb pour n
chromosomes et répartis dans 22 autosomes
+ 2 chromosomes sexuels
• Génome mitochondrial : 16 559 pb, épisome
• Aucune corrélation entre la taille du génome
et la complexité des organismes
• Plus grands génomes : > 150 109 pb : pins,
plantes
COMPOSITION DU GENOME HUMAIN
Des gènes : environ 25 000 composés de séquences
codantes ( exons) et non codantes (les introns,
séquences régulatrices; promoteur, silencer,
enhancer …)
régions codantes : 1.5% du génome ;
introns 25%, région régulatrices: 5%
Des Pseudogènes 1.5%
De très nombreuses séquences répétèes 60%
Autres régions non codantes : séquences uniques
ou très peu répétées 7%
Séquences répétées
• Répétées en Tandem
• minisatellites : des séquences de 10 à 25 pb
sont répétées un grand nombre de fois
• ( empreintes génétiques)
• microsatellites : 1à 5 pb répétées x fois sur
plusieurs kb
• ADN satellite : centromères , télomères ( 10%
du génome humain)
Microsatellites
Dispersés sur tout le génome
1 à 5 nucléotides
Copies
A(n) / T(n)
107
(CG)n / (CA)n/ (GT)n
7  106
(CT)n / (GA)n
3 x 106
Les plus étudiés (CG; CA)n
CG
n = 23
CGCGCGCG

TANDEM
n = 20
n = 15
• Séquences répétées dispersées
Les SINE(s) blocs de 130 à 500 pb ( Alu)
Les LINE(s) blocs de 5- 7 kb
Les LTR(s) quelques dizaines de paires de bases
( 400 000 copies)
Les transposons ( 300 000 copies)
Séquences répétés dispersées
SINEs : Famille ALU
Copies : 7  105
250-400
pb
104 pb
250-400
pb
ALU
ALU
Famille Kpn (L1)
1300 pb
copies 6  104
Peuvent être transcrites
Séquences SINEs
ALU REPEAT
120
135
290
(AAA)n
AT RICH
GC RICH
GC RICH
(AAA)n
Eléments transposables
IS éléments
2600 – 700 pb
5'  3'
3'  5'
CTGACTT
TTCAGTC
Répétition aux extrêmités (Maïs)
Gène
Séquence d'acides nucléiques contenant une
information codée, transmissible, pour la production
régulée d'un ARN (transcription), ce dernier pouvant
être traduit en une chaîne polypeptique
Certains gènes codent seulement des ARN sans
traduction en protéine
Les gènes des rétrovirus sont
constitués d'ARN
Pseudogènes
• Séquences partiellement homologues aux gènes qui ne
donnent jamais de protéines correspondantes
 Soit anciens gènes fonctionnels qui ont muté
 Soit des ARN  retro-transcrit  ADN 
intégration ADN génomique ( transposition)
• ANATOMIE DU GENE b globine
3' UTR
5' UTR
Zone des promoteurs
1
30
Exon I IVS1
31
104
Exon II
105
IVS2
Gène b globine
1600 pb
146
Exon III
Région régulatrice en 5'
Zone des promoteurs
Facteurs de
transcription
-105
-100
-80
-70
-30 -25
CAP
CACCC
CACCC
A
G CCCCC
G
CCAAT
TATA A/T A A/T
Site d'initiation de la transcription
Région 5' non Traduite
5' UTR
CAP
Codon initiateur
8
-
13
+30...... CACCATG
+50
0
CTTCTG
Région 5' UTR
- Attachement aux ribosomes
- Régulation transcription +/-
Exon
Partie codante d'un gène 
protéine
ATG
Exon 1
IVS1
30
Exons  Traduction  protéine
IVS1
Exon 2
130 pb
Zone non traduite
GT
AG
Donneur de l'épissage
Accepteur de l'épissage
Région 3' UTR
Codon 147
146
STOP
AATAAA
20
AAAAAA
132 Nucléotides
AATAAA
: Signal de polyadénylation
: Clivage de l'ARN après transcription
(AAAAA)n : Stabilise l'ARN ( ajouté après la transcription)
II ETUDE DU GENOME
A- Les expériences fondamentales qui
ont révélé l’ existence de l’ADN comme
Génome
• L’ Etude du génome complet d’un individu
est très récente et découle du séquençage
d’un génome entier ( début XXI)
• C’est l’analyse de l‘ADN
• Elle était indirecte avant l’invention des
techniques du séquençage (1977)
• Elle utilisait l’étude des protéines qui
renseignaient indirectement sur les gènes
• Des mutants de bactéries , de drosophiles
Origines de l’étude du Génome
• Dès le XIX siècle : l’étude de la transmission des caractères
sur des critères d’analyses qualitatives et statistiques
( Lois de Mendel 1860)
Mise en évidence de l ’ADN (1865)
Génétique formelle Morgan ( 1920 drosophile) critères
d’analyses qualitatives et statistiques
• Puis des techniques bactériologiques et biochimiques ont
permis de franchir une étape dans le degré d’investigation de
l’étude des génomes ( 1920-1952)
• Structure ADN (1953 )
Expérience de Griffith (1928)
Bactérie : Diplococcus
pneumoniae
2 souches
S = capsule polysaccharidique
> infectieux
R = dépourvue de capsule
> non infectieux
Des lots de souris
• Groupe1 : Injection souche S à des souris >
pneumonie
• Groupe 2 : Injection souche R > pas d’infection
• Groupe 3 : Injection d’une souche R + souche S
préalablement tuée par la chaleur
• => pneumonie
RESULTAT
• Le sang des souris du groupe 3 est mis en
culture : on recueille soit des souches R soit
des souches S virulentes ...
• L’expérience fût refaite en 1944 avec la
conclusion que l’ADN était le matériel
héréditaire
Avery, Mac Leod, Mac Carthy
• Interprétation : Les souches S tuées sont capables
d’induire une transformation des bactéries R en
bactéries S
Quelle est la nature de ce matériel transmissible ?
• En ajoutant l’ ADN purifié des souches S à des
colonies de type R les colonies R > S
• Les autres fractions (polysaccharides,protéines)
n’ont pas de pouvoir transformant...
• Lorsque l’ADN des souches S est traité par la
DNAse avant d’être ajouté aux bactéries de
souche R > pas de bactérie de type S
• La transformation des souches R en souche S
est la conséquence d’un transfert d’ADN
• L’ADN est donc le matériel génétique
De 1944 à 1952 une partie de la
communauté scientifique n’était toujours pas
convaincue par cette conclusion et
l’hypothèse que les protéines étaient le
matériel héréditaire était encore défendue
• Colette VENDRELY ( professeur
d’embryologie à Amiens ) & R. VENDRELY
démontrent en 1949 que la quantité d‘ADN
présente dans les gamètes est la moitié de
celle contenue dans les cellules somatiques.
• Ce résultat est le seul travail français
internationalement cité comme contribution
majeure à la preuve de l’ADN comme
matériel héréditaire
UN pas décisif vers la découverte
de la structure de l ’ADN
En 1950 Erwin Chargaff découvre que
l'adénine et la thymine existent en quantités
égales, et qu'il en est de même de la guanine
et de la cytosine, d'où la célèbre équation
%A=%T
%G=%C
Expérience Hershey & Chase
• 1952, ils démontrent en utilisant le phage T2
traité au tritium * (acides nucléiques radioactifs) que les ADNs répliqués sont radioactifs.
• Les protéines ne sont pas radioactives donc ne
se répliquent pas …
Découverte de la structure de l’ADN 1953
Découverte de la structure de l’ADN
“ It has not escaped our notice that the specific pairing we have
postulated immediately suggests a possible copying mechanism
for the genetic material ” .
• « Il n’ a pas échappé à notre attention que la
les appariements spécifiques que nous
proposons suppose immédiatement un
mécanisme de copie du matériel génétique »
• Le modèle de réplication semi-conservatif sera
prouvé en 1958 par Meselson et Stalh
Le modèle semi conservatif de la réplication
• Le bon modèle pour 3 possibilités
modèle conservatif
A partir d'une molécule d'ADN
bicaténaire "mère", on forme une
nouvelle molécule d'ADN bicaténaire.
On garde donc ici une molécule "mère",
non modifiée (elle est donc conservée),
tout en "créant" une nouvelle molécule
("fille").
On ne conserve aucun brin intact.
La copie se réalise par fragments
dispersés dans l'ensemble de
l'ADN, permettant de former les
deux molécules d'ADN bicaténaires
"filles".
Dissociation des deux brins de la
molécule d'ADN bicaténaire "mère".
Chaque brin sert donc de matrice à la
synthèse d'un brin complémentaire,
l'ensemble reformant une molécule
d'ADN bicaténaire. Chaque nouvelle
molécule "fille" ne conserve donc que
la moitié de la molécule mère
Dans le tube 0 la totalité de l’ADN est marqué à l’ azote 15
( les 2 brins) . Après une réplication la moitié de l’ADN est
radio actif . Au fur et à mesure des réplications la quantité
d’ADN marqué diminue l’ADN au profit d’abord d’ ADN
hybride , puis d’ADN froid.
Le résultat observé après séparation des ADNs répliqué correspond au modèle semi conservatif
Propriétés physico-chimiques
• Déroulement de tout l’ ADN d’une cellule
d’un individu : 1.6 Mètre
• Déroulement de l’ADN de toutes les cellules
d’un individu : diamètre du système solaire!
• ADN cellulaire : 6,6-6,4 x 10 9 pb (2n)
Quelques valeurs …
• Pb = 6 .10 9
• Masse Moléculaire = 2x330 g x 6.109 /6,02.1023 moles de
nucléotides
• > = 6,6.10-12 g d’ADN
• Il y a environ 6 picogrammes d’ADN dans une cellule diploide
• 1 µg d’ADN génomique -> 10-6 g /6.6 10-12 g/cellule >>
• 107 cellules diploides
II ETUDE DU GENOME
• B) LES OUTILS
B- 1- PURIFICATION DE l’ ADN
Méthode au Phénol / Chloroforme
•
•
•
•
•
•
•
Purification des cellules
Lyse des cellules ( SDS, Lysozyme)
Action protéinase K, Rnase
Extraction au phénol
Action du CHCl3
Précipitation dans l’éthanol en milieu salin
Re-suspension en présence de tampon TRIS EDTA ( 1 mM) ( 100 microG / microl)
B-2 Les Enzymes de Restriction
• Sont des ciseaux moléculaires qui hydrolysent
l’ADN; Ils reconnaissent des séquences
palindromiques (Ex RADAR)
• Ils permettent de mette en évidence des
variations de séquence ( polymorphismes,
mutations)
• Ils sont utilisés en génie génétique ( clonage)
• En diagnostic de routine en génétique
médicale
Des enzymes de Restriction
• 5'-G*GATCC-3'
• 3'-CCTAG* G-5’
Bam HI
• 5 '-G -3' --- 5'- GATCC-3'
• 3'-CCTAG-5' ----> 3'- G-5'
B-3 L’ Hybridation et les sondes
• Hybridation par complémentarité de
séquence et appariement des bases
• Sonde : petite séquence d'ADN ou d'ARN
marquée par un composé fluorescent, ou
radioactif
• Les sondes doivent être spécifiques d’une
séquence et très sensibles.
• Utilisation diagnostique
S
I
M
P
L
E
B
R
I
N
100
ADN hautement répétitif
60
ADN moyennement répétitif
ADN peu répétitif
20
%
Copies uniques
10-2
10-3
100
101
Cot (mole  sec .l-1)
Rapide
Lent
Taux de Renaturation
102
104
B-4 Application sondes et ER : "POLYMORPHISME"
Plusieurs Formes
Toute variation de séquence de l'ADN, qu'elle soit ponctuelle
ou qu'elle intéresse une répétition de mini / micro satellites est
un polymorphisme si sa fréquence est  1 % dans une
population donnée
à une fréquence < 1 % mutation (privée)
Les polymorphismes sont soit :
- Neutres
- Avantageux
- Désavantageux
Les Polymorphismes
L'ADN n'est pas un élément statique
Il est sujet à des modifications transmissibles
Les variations de séquence sont appelées
polymorphismes lorsqu'elles surviennent à une fréquence
> 0.01 (moins de 1 % : mutations)
L'hétérozygotie moyenne de l'ADN humain est d'environ
0,004 (1 base différente toutes les 250 - 300 bases entre 2
allèles ou 2 séquences, entre 2 individus)
Le polymorphisme affecte toutes les régions de l'ADN
- Séquences codantes
- Introns
- ADN répété (mini, microsat…)
Il peut modifier :
- 1- Un site de restriction
- 2- La longueur d'un motif répété
Un polymorphisme peut induire une  longueur
détectable par enzyme de restriction
Microsatellites
Minisatellites
Les polymorphismes du DNA servent à son
analyse
RFLP
Un RFLP est défini par un couple : Sonde / Enzyme
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Sa localisation précise, sa variabilité et sa transmission
mendélienne lui confèrent un caractère de marqueur
génétique codominant.
Le couple sonde / enzyme se caractérise par : + / - et
correspond à un bi-allélisme
Les RFLPs sont mis en évidence par la méthode de
Southern ou PCR
Pour être informatif : le RFLP doit être reconnu par une
sonde unique
On distingue des sites de restriction obligatoires (toujours
présents) et des sites de restriction variables
 Polymorphisme
Mst II
1
2
3
4
5
20Kb
Chez un individu sur 100 on découvre

Exemple
EcoR1
reconnaît, puis hydrolyse
5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'
Si cette séquence est mutée l'enzyme ECOR1 ne peut plus hydrolyser l'ADN à cet
endroit.
A
B
GAGTTC
CTCAAG
(A + B)
Marqueur
Position non connue avec précision
Eco RI+
Eco R1-

Gène
4kb
Gène muté  maladie
M
5kb
Ces fragments peuvent être différencier par leur taille
Polymorphisme de Répétition
EcoRI
EcoRI
(CA)n
Allèle A
200 pb
EcoRI
+ 2(CA)n
Allèle B
300 pb
sonde
A/B
300
200
A/A
B/B
EcoRI
III- LES TECHNQIUES
A - La méthode PCR
Polymerase chain reaction
Avantage de la Technique
• Elle permet d’étudier un segment d’ ADN au sein
de tout le génome si l’on connaît sa séquence
• Elle permet de recopier ce segment (amplification
des millions de fois et de le visualiser par une
méthode électrophorétique
• Par coloration au bromure d’éthidium ou autre
colorant
• Ce segment peut être par la suite traité pour
mettre en évidence une mutation
• Pour le cloner
Principe
• Succession de réactions de réplication d'une
matrice double brin d'ADN.
• Chaque réaction met en oeuvre deux amorces
oligonucléotidiques dont les extrémités 3-prime
pointent l'une vers l'autre.
• Les amorces ou «primers» en anglais définissent
alors, en la bornant, la séquence à amplifier.
• Les amorces sont orientées dans le sens 5’ vers
3’
• Chaque produit de chaque étape de
synthèse sert de matrices pour les étapes
suivantes. Au lieu d'être linéaire,
l'amplification obtenue est exponentielle.
• Imaginée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel
de Chimie dès 1993), la technique connaît un
essor considérable à partir de la
commercialisation (vers 1988), d'une ADN
polymérase résistante aux températures
élevées (la Taq polymérase), qui permet une
automatisation de la technique en
supportant les sauts de température
On opère avec des sauts de température à
chaque étape
• EN effet, une température dite d’annealing
permet l’hybridation de l’amorce avec l’ADN
• ( 56°)
• A une autre température , c’est l’ élongation
ou extension ( 72 ° C)
• A une dernière température les brins amplifiés
sont séparés : température de dénaturation
• ( 94°c )
• http://www.enslyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation
.htm
Ou Principe de la PCR > ( google)
www.enslyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm
• On peut ainsi amplifier assez facilement une
région couvrant 2000 pb
• Des amplifications de morceaux plus longs
sont possibles mais plus délicates ( 10 000 pb)
B- GAP-PCR / Application de la méthode PCR
au diagnostic de grandes délétions
Les délétions mises en évidence par la méthode
PCR
Des amorces choisies pour être très éloignées
l’une de l’autre lorsqu’il n’existe pas de
délétion , ne permettront pas un amplification
En cas de délétion, les amorces sont rapprochées
et l’ADN amplifié signe alors une délétion.
Dodé C, Krishnamoorthy R, Lamb J, Rochette J.
Br J Haematol.1993 Jan;83(1):105-11
Distance entre A4 et A9 = 1800 pb : si les gènes alpha 1 et alpha 2 sont présents la
Région amplifiée est de 194pb entre A4 et A1B. Si ,les deux gènes sont délétés la
distance entre A4 et A9 est raccourcie et l’amplification révèle un fragment de 550pb.
C- LA PCR INVERSE ou Reverse
Transcriptase PCR ( RT-PCR)
• La RT-PCR a été mise au point pour utiliser les
ARN comme matrice d'amplification de la PCR
• On isole des ARN m par purification spécifique de
de ces derniers
• Ils sont ensuite « recopiés » en ADN par une
enzyme : la transcriptase reverse
• On réalise une PCR comme précédemment
• Le produit final est un ADN dont l'un des brins est
complémentaire de l'ARN d'intérêt et l'autre brin a la
même séquence que cet ARN d'intérêt (à la
substitution près de U par T).
Difficultés Techniques
• La contamination des échantillons par de
l'ADN génomique est une des principales
difficulté de cette technique.
En effet, l'ADN génomique peut entrer en
compétition avec l'ADNc pour lors de l'étape
d'hybridation des amorces. Diverses parades
sont alors utilisées :
Parades
• 1 Des ARNm eucaryotes polyadénylés
peuvent être purifiés par chromatographie de
l'ARN cellulaire total sur une colonne où sont
immobilisés des oligo-dT (oligonucléotides
constitués de désoxythymidines).
• 2 Les ADN présents dans l'échantillon
peuvent être détruits par ajout d'une activité
désoxyribonucléase (dépourvue d'activité
ribonucléase).
• 3 Choisir les amorces aux bornes d'un intron.
Ainsi, les produits d'amplification issus de
l'ADNc et ceux issus d'ADN génomique
contaminant seront distingués selon leur taille
: les fragments issus de l'ADN génomique
(contenant l'intron) auront une taille
supérieure aux fragments d'amplification issus
de l'ADNc (ne contenant pas l'intron).
D- MUTAGENESE DIRIGEE
• Réalisation d’une amorce mutée
• l'extrémité 3' doit rester complémentaire de
la séquence de matrice à amplifier (initiation
de la polymérisation)
l'extrémité 5' qui peut porter de nombreuses
modifications : des mutations ponctuelles, des
sites de restriction, des séquences de
recombinaison etc.
Mutation à des extrémités
Principe
• Les amorces 1 et 2 sont des amorces mutées (la
région 5' qui porte la mutation est symbolisée par
un rectangle rouge). Obtenues par synthèse
chimique .
Ces amorces sont complémentaires (le
recouvrement des régions 5' mutées en rouge est
particulièrement important pour la suite).
Les amorces 3 et 4 bornent le segment d'ADN à
modifier. Elles détermineront la longueur du
produit final.
• Deux réactions de PCR sont effectuées en
parallèle :
Une PCR avec les amorces 2 et 3 donne un
produit d'amplification correctement muté
dans la région désirée, mais de petite taille
• Une PCR avec les amorces 1 et 4 donne aussi
un produit muté, mais toujours de taille
insuffisante.
• Les deux produits de PCR sont purifiés , il
s'agit surtout d'éliminer les amorces 1 et 2
• On regroupe dans le même tube tous les
produits PCR
• Ils possèdent en commun la région mutée
(région d'ADN possédant un rectangle rouge).
L'hybridation de ces deux fragments par cette
partie commune est critique pour la dernière
étape.
• Une dernière PCR utilisant les amorces 3 et 4
est alors réalisée sur ce mélange et donne, en
effet, un fragment de la taille souhaitée
contenant la mutation.
IV LE SEQUENCAGE
• ADN
• ARN
Séquençage de l’ADN . F SANGER
(1977)
Séquençage de l’ADN :Walter GILBERT
LE SEQUENCAGE PAR LA METHODE DE
SANGER
• On copie le brin à séquencer de telle sorte que les copies
soient radioactives (ou repérables par un autre marquage :
fluorescence )
• Soit la séquence suivante à déterminer :
• 3’ …… G C A T G A T C G G 5’
• ……Amorce présentera une extrémité 3’ OH libre
• Il faut choisir une amorce complémentaire d’un bout de
séquence connue
•
•
•
• La DNA polymérase réplique 5' 3' à partir
3'OH libre de l’amorce
• en présence d'un 2, 3 didéoxynucléotide la
réplication est stoppée.
• Statistiquement on observera des fragments
d'ADN de tailles différentes en fonction de
l'incorporation du 2, 3 didéoxynucléotide
pendant la réplication du brin à séquencer
•
•
•
•
•
Tube 1
4dNTP, ddGTP
3' GCATGATCGG
CG#
CGTACTAG#
• Tube 2
• 4dNTP, ddATP
• 3'GCATGATCGG
• CGTA#
• CGTACTA#
•
• Tube 3
• 4dNTP, ddCTP
• 3' GCATGATCGG 5'
•
•
•
•
ddC #
CGTAC#
CGTACTAGC#
CGTACTAGCC#
• Tube 4
• 4dNTP, ddTTP
• 3' GCATGATCGG 5'
• CGT#
• CGTACT#
Tube 1 : ddGTP
1er fragment : 2 bases
2nd fragment : 8 bases
Tube 2 : ddATP
1er fragment : 4 bases
2nd fragment : 7 bases
Tube 3 : ddCTP
1er fragment : 1 base
2nd fragment : 5 bases
3ème fragment : 9 bases
4ème fragment : 10 bases
Tube 4 : ddTTP
1er fragment : 3 bases
2nd fragment : 6 bases
• Remarques :
• Il n'y a jamais deux fois la même taille quelque
soit le tube examiné
• Les produits sont radioactifs, ils vont être
repérés par autoradiographie après
électrophorèse en gel d'acrylamide.
• Les fragments migreront d'autant plus vite
que leur masse moléculaire est faible.
• La lecture se fera de 5’ vers 3 ‘ en
commençant par les fragments les plus petits
( du bas vers le haut)
• On lit donc
• Lecture : 5' CGTACTAGCC 3'
• Séquence : 3' GCATGATCGG 5‘
• On donne le produit complémentaire du
produit de lecture :
• 3’ …… G C A T G A T C G G 5’
Sanger Centre-Cambridge
Sequençage direct de l’ARN
•
•
•
•
•
ON ne transforme pas en cDNA
Des séquences de poly T sont bloquées sur un support
Le support capture les ARN par leur extrémité poly A
3’dA : 3’ Desoxy A bloque la fin de séquence d’ARN
Il sont ensuite complétés avec addition de Thymidine
non marquée
• Puis bloqués avec des nucléotides fluorescents A et C
et G , dit terminateurs + Polymérase.
• Cette méthode permet le début d’une lecture par
fluorescence là où commence le RNA et ne lit pas le
poly A .
V- ANALYSE DE l’ADN Par les
méthodes de séparation de fragments
La Séparation des fragments d’acides nucléiques
V-A Techniques Electrophorétiques
Les macromolécules chargées électriquement
peuvent migrer dans un champ électrique.
La densité de charge par unité de longueur est la
même dans l’ARN et l’ADN (contrairement aux
protéines). La migration s’effectue du Pôle - vers le
Pôle + du générateur.
La différence de migration se fera donc par la taille
Le support de migration ( acrylamide, agarose)
jouant un rôle de filtre, les fragments les plus petits
migreront plus rapidement que d’autres plus longs
dans le dispositif classique.
Coloration au Bromure d’éthidium
sous lampe UV
La migration s’effectue du haut vers
bas . Les fragments les plus petits sont
en bas du gel de migration
Électrophorèse d’ADN humain sans
hydrolyse par ER : Smear
V-B LA METHODE DE SOUTHERN
• http://www.univrouen.fr/ABISS/L1/WEB/empr
einte/southernblot.html
SOUTHERN BLOT
• 1) Extraction de l'ADN des différents génotypes à
analyser
• 2) Digestion de l'ADN par un enzyme de restriction.
On obtient alors des fragments d'ADN de longueurs
différentes selon les individus. Cette différence de
taille est due a une différence du nombre de site de
restriction qui varie selon les individus. l'ADN à
analyser est fragmenté en séquences plus ou moins
longues en fonction du polymorphisme de longueur
des fragments de restriction.
• 3) Ces fragments de restriction sont séparés
selon leur taille par une électrophorèse en gel
d'agarose. L'ADN étant chargé négativement,
il migre de la cathode vers l'anode. Les
fragments les plus petits sont les plus rapides.
• 4) LE BLOT / L'ADN est ensuite transféré sous
forme dénaturée ( NAOH, KOH, 1M) sur une
membrane de nylon. La position relative des
fragments d'ADN est préservée durant le
transfert.
• 5 ) L’ HYBRIDATION :
• La membrane est incubée dans une solution
contenant une sonde marquée préalablement, soit
par la radioactivité, soit chimiquement. La sonde
s'hybride alors avec le ou les fragments d'ADN avec
lesquels elle présente une homologie.
• On utilise couramment deux types de sondes :
•
les sondes génomiques (ADNg)
•
et les sondes d'ADN complémentaire (ADNc).
• Les sondes génomiques sont
obtenues par digestion de l'ADN
total du génome nucléaire de
l'espèce étudiée à l'aide d'un
enzyme de restriction. Les sondes
d'ADNc correspondent
nécessairement à des gènes
exprimés, puisqu'elles sont
obtenues à partir des ARN
messagers.
• 6) L'endroit, ou les endroits, où la sonde s'est
fixée sont révélés en plaçant la membrane au
contact d'un film sensible à la radioactivité
(figure), ou en réalisant une réaction
enzymatique colorée spécifique..
4.2Kb
4kb
2Kb
Interprétation des résultats
considérant 2 allèles
Sites Eco R1
4Kb
2Kb
Sonde
4.2kb
Site polymorphe sur le 2 ième allèle :
Interprétation du résultat
• Des individus sont 4/2 // 4/ 2 (homozygotes)
• Des Individus ne montrent aucune hybridation
• -- Délétion d’au moins 6 kb (homozygote)
• Le dernier : 4/2 // 4.2/2 : ses deux allèles sont
différents ( hétérozygote)
Diagnostic de la drépanocytose
• Maladie génétique fréquente en Afrique noire
au Moyen Orient et en Inde . Maladie
récessive
Mutation ponctuelle par substitution Glu > Val
sur le gène beta globine ( codon 6)
GAG > GTG
Cette mutation supprime un site de restriction
pour l’enzyme Mst II
LE NORTHERN BLOT
• // Southern BLOT
• Isolement de l’ARN colonne oligo dT
• Electrophorèse sans dénaturation , sans
hydrolyse
• Hybridation avec une sonde monobrin
LA GENOMIQUE
• Science des Génomes
• La génomique regroupe un ensemble d'analyses qui vont :
•
•
- d’une cartographie physique de l’ADN
- d’ une cartographie des ARN messagers
•
•
- à l'identification de gènes , de
polymorphismes et de séquences d’intérêts
•
- à l'étude de leurs fonctions
Parler de brin sens ou antisens sur l'ADN n'a de sens (humour) que si nous nous
plaçons dans le contexte de la transcription.
Le brin sens est celui qui a la même séquence nucléotidique que l'ARN messager
transcrit (T / U mis a part bien sûr). Le brin antisens sert de matrice à la polymerase.
L'ARN est polymerisé de 5' vers 3'.
La matrice (brin "antisens") peut donc être représenté du 3' au 5'
Le brin complémentaire (brin "sens") est donc représenté du 5' au 3'.
sens
5’ -ATTTGCTGCCTT... TGC-3'
antisens 3'-TAAACGACGGAA.. ACG-5'
RNA messager : 5'-AUUUGCUGCCUU..UGC-3’
La lecture d’une séquence par la méthode de Sanger lit (en commençant par la talile
la plus petite ) de 5’ vers 3’ c’est à dire le brin sens
Cartographie de l’expression des
GENES
• Hybridation de l’ARN sur puces à ADN
Analyse totale du génome par utilisation de
l’expression différentielle des gènes
On construit des supports ou chip-arrays .
Chaque grille est un
carré de 11
micromètres
porteur de
séquences d’ ADN
(oligoprobe
( complémentaire à
Des Millions de brins de DNA gréffés et
accessibles
6.5 millions de brin sur chaque chip
Brins = 25 base pairs
celle de séquences
de gènes)
Chaque espèce d’ARN va hybrider avec la sonde d’ADN correspondante sur la puce
préalablment chargée de sondes d’ADN. La combinaison ARN biotinylé – ADN est fluorescente
et donc repérable par un système de lecture approprié
Fluorescent Stain
Biotin
RNA
RNA (purple) has bound to its DNA
probe built on the array
After staining, RNA (purple) bound
to the DNA probe built on the array
will fluoresce