Transcript transferencia de la información genética: transcripción

TRANSFERENCIA DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA:
TRANSCRIPCIÓN
Se denomina transcripción al proceso de trasvase de
información, contenida en el ADN, a una molécula de
ARN. Constituye el primer paso en la expresión de los
genes y mediante esta ruta se sintetizan todos los tipos
de ARN que existen en las células.
A primera vista, las cadenas de ARN y ADN pueden
parecer similares, con un grupo OH en la posición 2´de
la pentosa y la sustitución de la T por U como únicas
diferencias. Sin embargo, al contrario del ADN, la
mayoría de los ARN son de cadena sencilla. Estas
cadenas se pliegan sobre sí mismas, dando lugar a una
diversidad estructural mucho más amplia que la
observada en el ADN, gracias a la cual el ARN es capaz
de asumir una amplia variedad de funciones celulares.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA
TRANSCIPCIÓN
Desde el punto de vista del mecanismo, la transcripción
es semejante a la replicación del ADN. Es una reacción
de polimerización, se utilizan sustratos activados
(nucleósidos trifosfato), se necesita un molde (de ahí el
nombre de síntesis de ARN dependiente de ADN), la
dirección de síntesis es también 5´→ 3´ y transcurre en
3 etapas: iniciación, elongación y terminación.
Existen también una serie de características que
diferencian ambos procesos:
– La transcripción es un proceso monocatenario.
Con pocas excepciones, sólo se transcribe una de
las cadenas del ADN. La situación de los genes a
copiar puede localizarse en cualquiera de las dos
cadenas del ADN. Por convenio, a la cadena
utilizada como molde se la llama hebra molde,
antisentido, no codificante o hebra (-) y a la
cadena complementaria se la denomina hebra no
molde, con sentido, codificadora o hebra (+). La
doble cadena se escribe de izquierda a derecha
en el sentido 5´→ 3´ de la hebra codificadora. La
hebra codificadora del ADN tiene la misma
secuencia que la cadena de ARN transcrito
excepto que la timina sustituye al uracilo (Figura
1).
– Es un proceso selectivo. La transcripción se limita a una porción
del ADN. En una célula eucariota diferenciada, la parte del ADN
total que se transcribe es muy pequeña. Incluso en los
organismos unicelulares, en los que prácticamente todas las
secuencias del ADN pueden transcribirse, en un momento dado
se transcribe mucho menos de la mitad de los genes. En
consecuencia, gran parte del interés por la transcripción se
centra en los mecanismos utilizados para seleccionar
determinados genes y cadenas molde, puesto que esta
selección es la que gobierna en gran medida las capacidades
metabólicas de una célula.
– La transcripción es un proceso reiterativo, puede repetirse
infinidad de veces durante la vida celular. A este respecto, existe
una gran variabilidad en cuanto a la frecuencia de transcripción
de distintas regiones del ADN.
– Es un proceso conservador. No afecta a la estructura del ADN.
– No requiere cebador.
ARN POLIMERASAS
El descubrimiento de la ADNp y su dependencia de un molde de ADN fue
un estímulo para la búsqueda de una enzima que sintetizase ARN
complementario de un molde de ADN. Hacia 1960, cuatro grupos de
investigación independientes habían detectado una enzima en extractos
celulares capaz de formar un polímero de ARN a partir de ribonucleótidos
5´-trifosfato. Investigaciones posteriores con la ARN polimerasa (ARNp)
purificada de E. coli contribuyeron a definir las propiedades fundamentales
de la transcripción.
La ARNp realiza múltiples funciones en la transcripción:
– Busca en el ADN los puntos de iniciación, también llamados secuencias
promotoras o, simplemente, promotores.
– Desenrolla una parte de la doble hélice del ADN para producir un molde de ADN
de una sola hebra.
– Selecciona el ribonucleótido trifosfato correcto y cataliza la formación del enlace
fosfodiéster. Este proceso se repite tantas veces como la enzima se desplace
unidireccionalmente a lo largo del molde de ADN. A este respecto, la ARNp es
totalmente procesiva: una única molécula de ARNp realiza la transcripción desde
el inicio hasta el final.
– Detecta las señales de terminación que indican dónde finaliza la transcripción.
– Interacciona con las proteínas activadoras y represoras (factores de
transcripción) que modulan en un amplio intervalo la velocidad de transcripción.
La química de la síntesis del ARN tiene mucho en común con la síntesis de ADN. La
ARNp elonga una cadena de ARN por adición de ribonucleótidos al extremo 3´-OH
de la cadena y sintetiza el ARN en dirección 5´→3´. El 3´-OH actúa como nucleófilo,
atacando el fosfato  del ribonucleótido trifosfato entrante y liberando pirofosfato
(Figura 2). La reacción global es:
(NMP)n + NTP → (NMP)n+1 + PPi
ARN
ARN alargado
La ARNp requiere ADN para su actividad, siendo
más activa con un molde de ADN bicatenario. La
hebra molde es copiada en la dirección 3´→5´
(antiparalela a la nueva cadena de ARN) al igual
que en al replicación. Cada nucleótido en el ARN
recién formado es seleccionado según las
interacciones de apareamiento de bases de Watson
y Crick; en este caso los residuos de uridilato se
insertan en el ARN para aparearse con residuos
adenilato del ADN molde. La geometría de los
pares de bases también puede jugar un papel en la
selección de las bases, tal y como hemos visto en
la replicación.
A diferencia de la ADNp, la ARNp no necesita un
cebador para iniciar la síntesis. El grupo 5´trifosfato del primer residuo de una cadena de
nueva síntesis no es cortado para liberar PPi, sino
que se mantiene intacto durante toda la
transcripción.
La ARNp dependiente de ADN de E. coli es una
enzima compleja y de gran tamaño formada por 6
subunidades de 5 tipos distintos (2´). El
núcleo de la enzima está constituido por 2´ y
presenta la actividad catalítica. La subunidad  se
une transitoriamente al núcleo y dirige a la enzima
hacia sitios específicos de unión en el ADN
(promotores), participa en la iniciación de la síntesis
y luego se disocia del resto de la enzima. Estas 6
subunidades contituyen la holoenzima ARNp.
(Figura 3 y Tabla 1)
Tabla 1. Composición de subunidades de la ARN polimerasa de E. coli
Las ARNp carecen de actividad exonucleasa
3´→5´correctora de pruebas. En consecuencia,
durante la transcripción se produce un error por
cada 104 o 105 ribonucleótidos incorporados en
el ARN. Dado que de un solo gen se producen
muchas copias de ARN y que todos los ARN son
finalmente degradados y reemplazados, un error
en una molécula de ARN tiene menos
consecuencias para la célula que un error en la
información permanente almacenada en el ADN.
ETAPAS DE LA TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS:
INICIACIÓN, ELONGACIÓN Y TERMINACIÓN
1) INICIACIÓN
La fase de iniciación comienza en los promotores del molde de ADN. Los promotores
son secuencias de ADN que dirigen a la ARNp hacia secuencias específicas
adyacentes para iniciar la transcripción.
Cuando se comparan las secuencias de muchos promotores de procariotas se pone
en evidencia un patrón llamativo (Figura 4). Existen dos tramos de secuencias
consensos situados a 10 y 35 pb antes del inicio de la transcripción.
Estas denominaciones hacen referencia a la hebra codificadora de ADN, aunque la
hebra molde o no codificadora de ADN es la que se transcribe en ARN. Por convenio,
se da el número +1 al par de bases en el que comienza la síntesis de ARN, y +n será
el último par de bases donde acaba la síntesis. Este último par de bases estará hacia
el extremo 3´ de la cadena codificadora, por lo que se dice que el movimiento de la
ARNp en esta zona es “aguas abajo”. La secuencia promotora, situada hacia el
extremo 5´ de la cadena codificadora, se dice que está “aguas arriba”, y se expresa 1 a –n.
Las secuencias promotoras consenso están a situadas a -10 (caja TATA o de
Pribnow) y -35, ya que se localizan hacia los nucleótidos 10 y 35 antes del punto de
iniciación. Cada una de estas secuencias tiene una longitud de 6 pares de bases. A
partir del análisis de muchos promotores se han deducido sus secuencias consenso
(promedio), estas son:
-35
-10
+1
5'-TTGACA-------------TATAAT-----Punto de partida para la transcripción
Figura 4. Típicos promotores de E. coli reconocidos por el holoenzima de la ARN
polimerasa que contiene 70. Se muestran las secuencias de la hebra no molde que son
leídas en la dirección 3' 5', como se acostumbra en representaciones de este tipo. Las
secuencias varían de un promotor a otro, pero la comparación de muchos promotores pone
de manifiesto similitudes, particularmente en las regiones -10 y -35. La secuencia
consenso de los promotores reconocidos por 70 es la segunda por arriba. Las regiones
espaciadoras contienen un número variable de nucleótidos (N). Sólo se muestra el primer
nucleótido que codifica el transcrito de ARN (en la posición +1).
INICIACIÓN
Los promotores difieren ampliamente en su eficacia. Los genes con
promotores muy activos se transcriben con mucha frecuencia, tan a
menudo como cada 2 segundos en E. coli, en tanto que los genes con
promotores poco activos pueden transcribirse una vez cada 10 minutos
o más. Las secuencias -10 y -35 de los promotores activos tienen
secuencias muy similares a las secuencias consenso, en tanto que los
promotores poco activos suelen presentar múltiples sustituciones en
estas secuencias. En efecto, la mutación de sólo una base tanto en la
secuencia -10 como en la secuencia -35 puede variar la actividad del
promotor. La separación entre estas secuencias consenso también es
importante: la distancia óptima es de 17 nucleótidos. Por tanto, la
eficiencia o actividad de una secuencia promotora sirve para regular la
transcripción. Las proteínas reguladoras que se unen a secuencias
específicas próximas a los promotores y que interaccionan con la ARN
polimerasa ejercen también una marcada influencia sobre la frecuencia
de transcripción de muchos genes.
El núcleo 2´ de la ARNp es incapaz de iniciar la transcripción en las
secuencias promotoras. Más bien, el holoenzima completo 2´ es
indispensable para la iniciación en el punto de partida correcto. La
subunidad  contribuye concretamente a la iniciación de dos maneras.
1º) Disminuye la afinidad de la ARN polimerasa por las regiones
generales del ADN. En su ausencia, el núcleo del enzima se une al
ADN fuerte e indiscriminadamente. 2º) La subunidad  permite a la ARN
polimerasa el reconocimiento de las secuencias promotoras. Se ha
encontrado que un amplio fragmento de la subunidad  presenta en su
superficie una hélice ; ésta hélice se ha asociado con el
reconocimiento de la secuencia de la región -10 (Figura 6). El
holoenzima se une a la doble hélice del ADN y se desplaza a lo largo de
ella en busca del promotor, haciendo una búsqueda unidimensional
utilizando el ADN como si fuesen los raíles de un tren. La búsqueda es
rápida ya que la ARN polimerasa se desliza a lo largo del ADN en vez
de asociarse y disociarse. La subunidad  se libera cuando la cadena
naciente de ARN tiene una longitud de 9 ó 10 nucleótidos. Tras esta
liberación, la subunidad  puede colaborar en la iniciación con otro
núcleo enzimático. (Figura 7)
INICIACIÓN
Aunque la ARN polimerasa puede localizar las secuencias promotoras cuando está
unida a la doble hélice de ADN, antes de comenzar la síntesis se debe desenrollar un
segmento de la hélice. Se debe desaparear una región de la doble cadena de ADN
de tal modo que los nucleótidos de una de sus cadenas sean accesibles para
emparejarse con los ribonucleósidos trifosfato entrantes. La cadena de del ADN
molde selecciona al ribonucleósido trifosfato correcto mediante la formación de pares
de bases Watson-Crick, al igual que en la síntesis del ADN.
¿Qué longitud de la cadena de ADN molde desenrolla la ARNp? Cada molécula de
ARNp unida desenrolla un segmento de ADN formado por 17 pares de bases. La
transición desde el complejo promotor cerrado (en el cual el ADN está como doble
hélice) al complejo promotor abierto (en el cual un segmento de ADN está
desenrollado) es un suceso esencial de la transcripción. En este momento todo está
preparado para la formación del primer enlace fosfodiéster de la nueva cadena de
ARN.
A diferencia con la síntesis del ADN, la síntesis del ARN puede comenzar de novo,
sin ser necesario un cebador. La mayoría de las cadenas nuevamente sintetizadas
portan en un extremo 5´una etiqueta muy diferenciadora: la primera base en ese
extremo es pppG o pppA. La presencia de un residuo trifosfato sugiere que la
síntesis del ARN comienza por el extremo 5´. Al igual que en la síntesis del ADN, la
cadena de ARN crece en sentido 5´ 3´.
ELONGACIÓN
La fase de elongación en la síntesis del ARN comienza nada más
formarse el primer enlace fosfodiéster. Un cambio importante es la
pérdida de ; recuérdese que el núcleo enzimático sin  se une con
mayor fuerza al molde de ADN. En efecto, la polimerasa permanece
unida a su molde hasta que se alcanza una señal de terminación. La
región que contiene la ARN polimerasa, ADN y la cadena creciente de
ARN se denomina burbuja de transcripción. La cadena de ARN en
crecimiento forma una hélice híbrida con la hebra molde de ADN. Esta
hélice ARN-ADN tiene una longitud aproximada de 8 pares de bases, lo
cual se corresponde, aproximadamente, con una vuelta de la doble
hélice. En esta hélice híbrida el grupo 3'-OH del ARN está posicionado de
tal modo que pueda atacar al átomo de fósforo  de un ribonucleósido
trifosfato entrante. Al igual que en la fase de iniciación, durante la fase de
elongación se desenrollan aproximadamente 17 pares de bases del ADN.
La burbuja de transcripción recorre unos 170 Å (17 nm) en un segundo,
lo que equivale a una velocidad de elongación de aproximadamente 50
nucleótidos por segundo. Aunque rápida, es mucho menor que la
velocidad de síntesis de ADN (800 nucleótidos por segundo). (Figura 8)
ELONGACIÓN
Las longitudes del híbrido ARN-ADN y de la región desenrollada del
ADN permanecen bastante constantes mientras la ARN polimerasa
se desplaza a lo largo del molde de ADN. Este hecho indica que la
velocidad de enrollado del ADN en la parte posterior de la ARNp es
aproximadamente igual a la velocidad de desenrollado en su parte
frontal. El híbrido ARN-ADN debe rotar también cada vez que se
añade un nucleótido de tal modo que el extremo 3'-OH del ARN
permanezca en el centro catalítico. La longitud del híbrido ARNADN está determinada por una estructura de la propia enzima que
fuerza la separación del híbrido ARN-ADN, lo que permite a la
cadena de ARN separarse de la enzima y a la cadena de ADN
reunirse con su complementaria. La continua apertura por delante y
cierre por detrás, de la burbuja de replicación, genera
superenrollamientos positivos por delante y negativos por detrás
que tienen que ser disipados por la acción de topoisomerasas.
TERMINACIÓN
Al igual que su iniciación, la finalización de la transcripción viene controlada de un modo
preciso. En la fase de terminación de la transcripción, cesa la formación del enlace
fosfodiéster, el híbrido ARN-ADN se disocia, la región de ADN fundido se enrolla y la ARNp
se desprende del ADN. ¿Qué es lo que determina dónde debe finalizar la transcripción? Las
secuencias transcritas de los moldes de ADN contienen señales de parada. La más sencilla
es una secuencia palindrómica rica en GC, seguida de una secuencia rica en AT. El ARN
transcrito de esta secuencia palindrómica es autocomplementario. Por tanto, sus pares de
bases pueden formar una estructura en horquilla con un vástago y un bucle, estructura
favorecida por su alto contenido en residuos G y C. Los pares de bases G-C son más
estables que los pares de bases A-T ya que tienen un puente de hidrógeno extra en cada
par de bases. Esta horquilla estable es seguida por una secuencia de cuatro o más residuos
de uracilo, los cuales son también cruciales para la terminación. La transcripción del ARN
finaliza en ellos o justo detrás (Figura 9)
¿Cómo finaliza la transcripción en esta estructura combinada horquilla-oligo(U)? Primero,
parece que la ARNp se detiene inmediatamente después de sintetizar la secuencia de ARN
que se pliega en horquilla. Aún más, la hélice híbrida ARN-ADN que se forma tras la
horquilla es inestable ya que sus pares de bases rU-dA son las más débiles de los cuatro
tipos existentes. Por tanto, la parada en la transcripción causada por la horquilla permite al
ARN en crecimiento débilmente enlazado disociarse del ADN y luego de la enzima. La hebra
sencilla de ADN se reasocia a su complementaria para regenerar la doble hélice de ADN y
se cierra la burbuja de transcripción.
La ARNp no siempre precisa ayuda para finalizar la transcripción en una horquilla seguida de
varios residuos U. En otros casos necesita la colaboración de un factor adicional para
terminar, la proteína ro (). Esta proteína es un hexámero que se une específicamente a una
hebra sencilla de ARN en un tramo de 72 nucleótidos, de tal forma que el ARN pasa a través
del centro de la estructura. La proteína  se activa mediante secuencias ricas en citosina y
pobres en guanina situadas en el ARN en crecimiento. La actividad ATPasa de  le permite
tirar del ARN naciente mientras que sigue a la ARNp. Cuando  alcanza a la ARNp en la
burbuja de transcripción, corta la hélice híbrida ARN-ADN actuando como una ARN-ADN
helicasa. (Figura 10)W3