Transcript Presentatie

30 januari 2014
Validatie bioanalyse volgens EMA-richtlijn
Yvo de Beer
Researchanalist MUMC+
30 januari 2014
European Medicines Agency
 Opgericht in 1995, London
 Grotendeels betaald door farmaceutische industrie
TAKEN
 Pre-autorisatie / Post-autorisatie geneesmiddelen
 Inspectie ( GMP / GLP )
 Communicatie / Administratie ( documentatie )
30 januari 2014
Traject opzet validatieprotocol
Guideline on bioanalytical method validation
Draft agreed by the Efficacy Working Party
Adoption by CHMP for release for consultation
End of consultation (deadline for comments)
Agreed by Pharmacokinetics Working Party (PKWP)
Adoption by CHMP
Date for coming into effect
September 2009
19 November 2009
31 May 2010
June 2011
21 July 2011
1 February 2012
30 januari 2014
Voorbeeld Comment Stakeholder
30 januari 2014
METHODEVALIDATIE
HPLC
GC
MS
VOLLEDIGE
VALIDATIE
PARTIELE
VALIDATIE
LIGAND BINDING
IMMUNO ASSAY
CROSS
VALIDATIE
VOLLEDIGE
VALIDATIE
PARTIELE
en
CROSS
VALIDATIE
VALIDATIERAPPORT
ANALYSE MONSTERS
HERANALYSE
FOUTIEVE RUNS
ANALYTISCH RAPPORT
HERANALYSE
AFGEHANDELDE
RUNS
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE









SELECTIVITEIT
CARRY-OVER
LLOQ
CALIBRATIECURVE
NAUWKEURIGHEID
PRECISIE
VERDUNNINGS EFFECT
MATRIX EFFECT ( MS )
STABILITEIT
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
 Uitvoeren in monstermatrix indien mogelijk.
 Gebruik van gecertificeerde referentiestoffen ( bv LCLABS, Lipomed,
LGC-standards ).
 Analysecertificaat verplicht ( opslag condities, exp-datum, batch )
 Interne standaard hoeft niet gecertificeerd te zijn ( geen anal. certif )
 Bij MS isotoop gelabelde I.S. aanbevolen. Check voor unlabeling
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
SELECTIVITEIT
 Minstens 6 verschillende blanco matrices.
 Bij interferentie:
response
<20% LLOQ.
<5% I.S.
 Co-medicatie
 Bij MS:conversie metabolietParent
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
CARRY OVER
 Injectie van zero sample na hoogste standaard tijdens validatie
 Concentratie <20 van LLOQ ( 5% I.S. )
 Indien >20 % blanco’s injecteren
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
LOWER LIMIT OF QUANTIFICATION
 LLOQ = laagste standaard calibratiecurve
 Response LLOQ minimaal 5x response blanco
 LLOQ niet hoger dan 5% van Cmax
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
CALIBRATIE CURVE








Range moet vooraf bekend zijn
LLOQ=laagste standaard, ULOQ=hoogste standaard
Minimaal 6 calibratiepunten
1 blanco ( zonder component(en) / interne standaard
1 “zero-sample”, met interne standaard
Calibratiepunten mogen in duplo, maar is niet verplicht
Rapporteer van curve: Slope, intercept, back-calculated concentraties
Minimaal 3 curves rapporteren
 Calibratielijn hoeft niet vers gemaakt te worden. Calibratiepunten
mogen opgeslagen worden ( bv bij -70°C ) en op een later
tijdstip gebruikt worden. Stabiliteit moet in dit geval worden
aangetoond
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
RAPPORTAGE CALIBRATIECURVE







Rapporteer van curve: Slope, intercept, back-calculated concentraties
Minimaal 3 curves rapporteren
Back-calculated concentratie ijkpunten <15%
Back calculated concentratie LLOQ <20%
Minimaal 75% van calibratiepunten moeten voldoen aan criteria
Bij duplo’s 50% per concentratieniveau moet voldoen
Indien er niet wordt voldaan aan criteriaMethode herzien (aanpassen)
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
ACCURACY
 QC’s bereiden uit andere stockoplossing
 Minimaal 4 QC’s maken: LLOQ
LOW QC (=< 3xLLOQ)
MED QC ( +/- 50% calibratierange )
HIGH QC ( minimaal 75% van calibratierange )
 Within run
minimaal 5x opwerken per level
 Between run
 minimaal 3x opwerken per level
 Eisen Within run
Gemiddelde berekende conc < 15%
Gemiddelde berekenede conc LLOQ <20%
 Eisen Between run
Berekende concentratie <15%
Berekende concentratie LLOQ <20%
 Minimaal 1 run size-equivalent uitvoeren
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
PRECISION
 VC between run
LLOQ
<15%
<20%
 VC within run
<15%
<20%
LLOQ
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
DILUTION INTEGRITY
Verdunning mag de nauwkeurigheid en precisie niet
beinvloeden. De verdunningsintegriteit moet worden aangetoond
door de matrix te spiken met analyt boven de ULOQ en deze te
verdunnen met blanco matrix ( minstens 5x per
verdunningsfactor ). De eisen die gelden voor de verdunde
monsters zijn voor nauwkeurigheid en precisie beide 15%
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
MATRIX EFFECT ( Massaspectromterie )
Zeer uitgebreid verhaal ( paragraaf 4.1.8 ). I
Hoofdpunten zijn:




6 verschillende blanco’s ( geen poolmonsters !! )
Bereken ratio spike in matrix / spike in oplossing ( analyt + I.S )
Uitvoeren bij lage conc. en hoge conc. ( max 3xLLOQ en bij ULOQ )
Wanneer bovenstaande niet uitvoerbaar is vanwege on-line sample
prep. Check variatie in response. CV <15
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
STABILITY
 Stabiliteit aantonen met QCLOW en QC HIGH
 Direct bepalen en wegzetten onder opslagcondities
 QC’s bepalen op vers gemaakte ijklijn
 Berekende concentratie QC’s binnen 15% van nominale waarde
 Duur stabiliteit studie ≥ leeftijd monsters
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
STABILITY ( VERVOLG )
 Stabiliteit stock en werk oplossingen ( analyten en interne standaard )
 Vries/dooi stabiliteit analyt in matrixminimaal 12 uur in diepvries tussen
cicli
 Korte termijn stabiliteit bij kamertemperatuur
 Lange termijn stabiliteit in vriezer ( -20 °C / -70 °C )
 Indien mogelijk Stabiliteit opgewerkt monster bij kamertemperatuur (bv
na droogdampen of in vial
 Stabiliteit in autoinjector
30 januari 2014
VOLLEDIGE VALIDATIE
VALIDATIERAPPORT
 Opsomming gevalideerde parameters
 Beschrijving methode ( analyten, IS,
monstervoorbwerking,extractie, analyse )
 Referentiestandaarden Bron, batch nummers, COA, stabiliteit en
opslag condities
 Run acceptatie criteria
 Tabel van alle runs met analysedatum ( goedgekeurd, afgekeurd,
reden afkeuring )
 Tabel van alle calibratieresultaten ( inclusief range, response
functie, terugberekende concentraties en nauwkeurigheid
 Tabel van QC resultaten van alle geaccepteerde runs ( within en
between run precisie en nauwkeurigheid. Waarden buiten de
grenzen duidelijk markeren
 Stabiliteitsdata stock/werk oplossing en QC’s
 Selectiviteitsdata, LLOQ, Carry-over, matrix effect,
verdunningsintegriteit
 Afwijkende resultaten en bijbehorende acties cq afwijking SOP
30 januari 2014
VALIDATION REPORT CAELYX®
HIGH LEVEL
VALIDATION REPORT CAELYX®
HIGH LEVEL
PROTOCOL No. UMCNONCO200902
PROTOCOL No. UMCNONCO200902

SUMMARY VALIDATION PERFORMANCES
The following performances are tested: Selectivity (co-medication and interference
endogenous components matrix), Stability autoinjector, Caelyx depegylation withinrun (dispersion test), Caelyx efficiency depegylation between-run (dispersion test),
Between-run doxorubicine/doxorubicinol, Within-run doxorubicine/doxorubicinol,
Freeze-thaw stability, 24 hour room temperature stability, Recovery, Stability
longterm ( pending )

ASSAY PROCEDURE
Doxorubicin, Doxorubicinol.
Analytes:
Daunorubicin
Internal standard:

REAGENTS / MOBILE PHASE
Sodiumacetate-buffer:6,8 grams / liter water ( Na-Ac. 3 H2O ). pH=4.0 with Acetic
acid
Zinksulfate 89g/L: 89 grams of ZnS04.7H20 in liter water
INSTRUMENTATION AND CONDITIONS
Shimadzu LC-20AT HPLC-pump with DGU 20A3-degasser
HPLC-system:
Waters 717plus autosampler
Jasco FP-920 Intelligent Fluorescence detector
HPLC-column:
Guard-column:
Mobile phase:
Needlewash:
Flow:
Excitation λ:
Emmission λ:
Bandwith:
Gain:
Temperature:
Runtime:
Injection volume:
APPLIED ANALYTICAL METHOD
Own method, based on articles Peter de Bruijn et al: Determination of doxorubicin en
doxorubicinol in plasma of cancer patients by high-performance liquid
chromatography ( Analytical Biochemistry 266, 216-221, 1999 ) AND David L. Chin
et al: Rapid determination of PEGylated liposomal doxorubicin and its major
metabolite in human plasma by ultraviolet-visible high-performance liquid
chromatography ( Journal of Chromatography B, 779 259-269, 2002 )
Triton 6% (v/v): 6 ml Triton X-100 in 100 ml water. Heat to 40 °C to dissolve.
1. 250 μL Standard/Blank/QC/Sample + 25 μL Triton 6% (v/v) in eppendorf®cup.
2. Mix 2 minutes on vortex
3. Wait 10 minutes
4. Add 250 μL internal standard mix (IS + deproteinization solution). Except for
blank 250 μL deproteinization solution without IS
5. Mix 2 minutes on vortex
6. Centrifuge 5 minutes at 10900 RPM
7. Transfer 250 μL in glas vial
8. Inject 5 μL onto HPLC-system


Waters Atlantis T3, 15 x 4.6 mm; 5 μm
Phenomenex Security Guard C18 4 x 3.0 mm
Acetonitril : Sodiumacetate buffer 25:75
Acetonitril : Water 25:75
2,0 ml/min
480 nm
560 nm
40 nm
100
Ambient
22 minutes
5 μL
Deproteinization solution: Zinksulfate 89g/L : Methanol ( 1: 1 )
Internal standard MIX: add 150 μL for every 3 mL of deproteinization solution


REFERENCE STANDARDS
COMPONENT
ORIGIN
BATCH NR
CERTIFICATE
STABILITY
Doxorubicin
Doxorubicinol
Daunorubicin
LC labs
Alsachim
Sigma
DXR-102
CM-ALS-11-088-P3
1352629V
YES
YES
NO
18-1-2016
21-9-2013
?
CALIBRATION STANDARDS AND QC SAMPLES
Standard solution
COMPONENT
WEIGHT
FACTOR
C
MATRIX
PREPARATION
PREPERATION
DATE
STORED
Daunorubicin
Doxorubicin
Doxorubicinol
.1 HCl
.1 HCl
.3 Fluoroacetate
1000 mg/L
1000 mg/L
1000 mg/L
Methanol
Methanol
Methanol
9.77 mg in 10 mL
10.84 mg in 10 mL
12.55 mg in 10 mL
28-09-2012
28-09-2012
28-09-2012
5 °C
5 °C
5 °C
Standard solution for QC samples
COMPONENT
WEIGHT
FACTOR
C
MATRIX
PREPARATION
PREPERATION
DATE
STORED
Doxorubicin
Doxorubicinol
.1 HCl
.3 Fluoroacetate
1000 mg/L
1000 mg/L
Methanol
Methanol
10.80 mg in 10 mL
12.32 mg in 10 mL
05-11-2012
05-11-2012
NONE
NONE
VALIDATION REPORT CAELYX®
HIGH LEVEL
VALIDATION REPORT CAELYX®
HIGH LEVEL
PROTOCOL No. UMCNONCO200902
PROTOCOL No. UMCNONCO200902
Calibration results
 RUN ACCEPTANCE CRITERIA
PARAMETER
Selectivity: Co-medication
Selectivity: Blank Matrix
LLOQ
Carry Over
Back Calculated
concentrations curve
Within-run Accuracy
Between-run Accuracy
Within-run Precision
Between-run Precision
Stability autoinjector
Stability Freeze-thaw
Stability long therm
Stability 24 hour
STORAGE
CONDITIONS
-20 °C
-20 °C
5 °C
CRITERIA
No interference
Response <20% of response analytes LLOQ
Response <5% of response IS
Signal >5 times signal blank
Response blank <20% of response analytes LLOQ
Response blank <5% of response IS
<15% for QC L,M,H
<20 % for QC LLOQ
<15% for QC L, M,H
<20 % for QC LLOQ
<15% for QC L, M,H
<20 % for QC LLOQ
VC <15% QC L,M,H
VC <20% QC LLOQ
VC <15% QC L,M,H
VC <20% QC LLOQ
<15% of nominal concentration
<15% of nominal concentration
<15% of nominal concentration
<15% of nominal concentration
PASSED
YES
YES
Calibration
date
15-11-2012
15-11-2012
12-11-2012
12-11-2012
13-11-2012
13-11-2012
14-11-2012
14-11-2012
REMARK
List componentsExcel file
YES
YES
Response
5.25 E-02 – 6.87 E-04
1.95 E-02 + 1.77 E-03
5.53 E-02 + 6.43 E-05
2.08 E-02 + 1.99 E-03
5.43 E-02 + 1.87 E-03
2.01 E-02 + 4.23 E-03
5.79 E-02 – 2.23 E-04
2.11 E-02 + 1.65 E-03
Back Cal.
Concentration
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Accuracy
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
Excel sheet
YES
Concentrations in plasma ( derived from St 1000 mg/L )
YES
CONC. DOXORUBICIN
mg/L
YES
Blank
Standard 0
Standard 1
Standard 2
Standard 3
Standard 4
Standard 5
Standard 6
QC 1 ( LLOQ )
QC 2 ( LOW )
QC 3 ( MED )
QC 4 ( HIGH )
YES
YES
YES
YES
PENDING
YES
 ANALYSIS
Analytical runs
REMARK
Range
0.5 – 50 mg/L DOXO
0.5 – 50 mg/L DOXOL
0.5 – 50 mg/L DOXO
0.5 – 50 mg/L DOXOL
0.5 – 50 mg/L DOXO
0.5 – 50 mg/L DOXOL
0.5 – 50 mg/L DOXO
0.5 – 50 mg/L DOXOL
PARAMETER
Selectivity: Co-medication
Selectivity: Blank Matrix
LLOQ
Carry Over
Back Calculated
concentrations curve
Within-run Accuracy
Between-run Accuracy
Within-run Precision
Between-run Precision
Stability autoinjector
Stability Freeze-thaw
Stability long therm
ANALYSIS DATE
08-11-2012
09-11-2012
11/12/13/14-11-2012
14-11-2012
11/12/13/14-11-2012
PASSED
YES
YES
YES
YES
YES
14-11-2012
11/12/13-11-2012
14-11-2012
11/12/13-11-2012
11-11-2012
14-11-2012
PENDING
YES
YES
YES
YES
YES
YES
YES
Stability 24 hour
14-11-2012
YES
Depegylation within-run
14-11-2012
Depegylation between-run
15/16-11-2012
Recovery
11/12/13-11-2012
QC LLOQ
QC LOW
QC MED
QC HIGH

CONC. DOXORUBICINOL
mg/L
0
0
0.5
1.5
5.0
10.0
25.0
50.0
0.5
1.5
25.0
40.0
0
0
0.5
1.5
5.0
10.0
25.0
50.0
0.5
1.5
25.0
40.0
DOXO WITHIN-RUN
DOXO BETWEEN-RUN
DOXOL WITHIN-RUN
DOXOL BETWEEN-RUN
95.6%
92.6%
93.9%
96.6%
97.8%
93.3%
96.2%
99.3 %
87.6%
94.7%
97.3%
98.4%
92.2%
98.1%
99.6%
98.8%
CV 2.9%
CV 1.5%
CV 2.3%
CV 1.0%
CV 1.2%
CV 3.1%
CV 1.3%
CV 2.6%
CV 3.4%
CV 2.1%
CV 1.6%
CV 1.7%
SUPPORTIVE DATA
All not summarized data can be found in Excel-file: “Validatie hoge gebied Caelyx
studie”
YES
YES
AddedExcel file
NO CRITERIA E.M.A
VALIDATION PERFORMED ACCORDING TO: European Medicines Agency EMEA/CHMP/EWP/192217/2009
VALIDATION DONE BY:
Y. de Beer
REPORT DATE:
10-12-2012
AGREED :
__________________
DATE:
__________________
CV 8.7%
CV 3.5%
CV 0.6%
CV 2.1%
ANALYTISCHE RUN
 Minimaal 6 calibratiepunten in enkelvoud
 Blanco + zero sample
 Minimaal 3 QC’s in duplo ( onafhankelijk ) of minimaal
5% van het totaal aantal monsters
 Studie monsters in enkelvoud ( in duplo mag )
 Acceptatiecriteria gelijk aan criteria validatie
 67% QC’s moet voldoen (+minstens 1 van de duplo)
ANALYTISCHE RUN
Mogelijke redenen voor heranalyse
 Afwijking van criteria
 Duidelijk verschil IS bij monsters en standaarden
 Apparatuur probleem
 Afwijking in LLOQ of ULOQ waardoor range
veranderd
 Analyt aanwezig in placebo
 Slechte chromatografie
ANALYTISCHE RUN
Heranalyse goedgekeurde runs
 Bij <1000 monsters10% heranalyseren
 Bij >1000 monster 5% heranalyseren
 Minder dan 20% afwijking t.o.v. gemiddelde voor 67%
van alle monsters
ANALYTISCH RAPPORT
 Vermelding referentiestandaard ( batch, COA,
stabiliteit etc )
 Opslag condities standaarden en QC’s
 Acceptatiecriteria
 Assay procedure
 Sample tracking ( codering monsters, opslag )
 Tabel alle runs ( datum, calibratieresultaten, QC
resulaten )
 Afgekeurde runs ( datum, reden )
 Andere afwijkingen
 Datasheet
LINKS EMA WEBSITE
Website: http://www.ema.europa.eu/ema/
Validatiedocument:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_lib
rary/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf
Commentaren op guideline:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_librar
y/Other/2011/08/WC500109687.pdf
VRAGEN / DISCUSSIE