Transcript Il sistema immunitario delle piante - e

Corso di Patologia Vegetale
Molecolare
Massimo Reverberi
Organizzazione del corso
• Periodo 04 Nov– 31 Jan
• 5 crediti lezioni frontali e seminari
• 1 credito esercitazioni pratiche (4 giorni in
laboratorio)
• Esame unico orale (date già online fino al
2016)
• Materiale didattico – slide in pdf caricate sul
sito docente di biologia + articoli e review
(ENG) fornite volta per volta dal docente
Organizzazione del corso
• Il programma prevede:
– Studio delle reazioni della pianta all’interazione con patogeni
• Riconoscimento
• Modulazione ormonale della difesa
• Risposte sistemiche
– Modalità di attacco dei principali fitopatogeni
•
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•
Virus
Batteri
Funghi
Insetti
– Seminari a tema su:
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Apoptosi nelle cellule eucariotiche
Lotta biologica con microrganismi benefici
Interazione pianta-insetti-funghi patogeni- microrganismi benefici
Le ricadute della ricerca di base nelle applicazioni biotecnologiche
Fare impresa con le biotecnologie – gli spin-off
La bioinformatica come tool per capire i dati -omici
Il sistema immunitario delle piante
• Le piante rispondono alle infezioni usando un
sistema immunitario innato a 2 rami
• Il primo ramo riconosce e risponde a molecole
comuni a molte classi di microbi patogenici e
non
• Il secondo risponde a fattori di virulenza del
patogeno sia direttamente o attraverso i loro
effetti sui bersagli dell’ospite
• Tutti i patogeni, usando strategie diverse,
rilasciano nelle cellule dell’ospite degli “effettori”
o fattori di virulenza capaci di aumentare le
chance di successo nell’infezione
Il sistema immunitario delle piante
• Le piante a differenza degli animali mancano di
cellule immunitarie mobili e di un sistema
immunitario adattativo somatico
• Quindi “confidano” nell’immunità innata di ogni
cellula e sui segnali sistemici che vengono inviati dai
siti d’infezione
• L’immunità innata delle piante è “gestita” da due
sistemi
– Il primo usa un insieme di recettori di riconoscimento
transmembrana (PRRs) che rispondono agli “slow
evolving” PAMP o MAMP (pathogen-microbe associated
molecular patterns) (es. la flagellina)
– Il secondo agisce principalmente all’intreno delle cellule
usando le polimorfiche proteine NB-LRR (nucleotide
binding-leucine rich repeat) prodotte dai geni R
• Le proteine NB-LRR sono correlate con le proteine
animali CATERPILLER/NOD/NLR e le ATPase STAND.
Sono codificate da più di 125 geni in Arabidopsis e da
circa 600 in riso
• Gli effettori di tutti i diversi patogeni (virus, batteri, funghi
etc) sono riconosciuti da proteine NB-LRR e attivano
simili risposte difensive
• La resistenza mediata dalle proteine NB-LRR è efficace
contro i patogeni biotrofici o emibiotrofi ma non contro i
necrotrofi
• Le risposte di difesa attivate dai geni R sono
qualitativamente molto simili a quelle attivate dai
patogeni virulenti durante l’infezione
Il modello zig-zag (zig..) a 4 fasi
• Nella fase 1 i PAMP o
MAMP sono
riconosciuti dalle
PRR.
• Tale reazione induce
l’immunità stimolata
dai PAMP o PTI che
può bloccare il
tentativo di
colonizzazione da
parte del patogeno
Il modello zig-zag a 4 fasi
• Nella fase 2 i
patogeni di successo
impiegano degli
effettori che
interferiscono con la
PTI
• Questa “interferenza”
dà origine alla
suscettibilità stimolata
dagli effettori (ETS)
Il modello zig-zag a 4 fasi
• Nella fase 3 un dato
effettore è riconosciuto da
una delle proteine NBLRR dando il via ad una
reazione di immunità
indotta dall’effettore (ETI)
• Il riconoscimento è sia
indiretto o tramite il
legame (diretto) tra un
recettore NB-LRR ed un
effettore
• L’ETI è una accelerata ed
amplificata risposta PTI il
cui risultato è,
generalmente, una
resistenza alla malattia e
una morte ipersensibile
(HR) nel sito d’infezione
Il modello zig-zag a 4 fasi
• Nella fase 4 la selezione
naturale porta il patogeno
a sviluppare degli
strumenti per “evitare”
l’ETI cioè evitare il
riconoscimento, mediante
“camuffamento” o
diversificazione del gene
che codifica per l’effettore,
oppure acquisendo degli
effettori addizionali che
reprimono l’ETI
• Ma, sempre la selezione
naturale risulta nella
generazione di nuove
specificità R che
consentono di stimolare
nuovamente l’ETI
La resistenza non ospite (RNO)
riveduta…
• Molte piante resistono alla maggior parte dei
patogeni per questo vengono chiamate nonospite
• La RNO può essere spiegata il almeno due
modi:
– Gli effettori del patogeno potrebbero essere inefficaci
su un ospite potenzialmente nuovo ma divergente da
un punto di vista evolutivo. Quindi non sarebbero in
grado di reprimere la PTI
– Alla luce della guard hypothesis uno o più effettori del
potenziale patogeno potrebbero essere riconosciuti
anche da uno degli NB-LRR di piante che non sono
ospite e quindi scatenare allo stesso modo l’ETI
..e corretta!
• La RNO in Arabidopsis verso un patogeno non proprio
(Blumeria graminis f.sp. Hordei) viene effettuata
mediante l’apposizione di nuovi strati di parete cellulare
e attraverso la produzione di metaboliti secondari tossici
per il patogeno nel sito di infezione ma non attraverso
l’HR
• I mutanti pen (penetration) di Arabidopsis sono
parzialmente compromessi in questo tipo di risposta
difensiva perché non producono le proteine PEN1-3
• PEN2 è una glucosil idrolasi perossisomiale e PEN3
codifica per una ABC transporter
• Queste 2 proteine sono entrambi coinvolte durante il
tentativo di penetrazione da parte del patogeno
probabilmente per mediare il rilascio polarizzato di una
tossina nell’apoplasto
La PTI
• La PTI è la prima risposta
attiva alla percezione del
patogeno
• La PTI viene iniziata dopo il
riconoscimento di strutture
microbiche evolutivamente
conservate da recettori
superficiali delle cellule
vegetali e la sua induzione è
associata con il signalling MAP
kinasico, l’induzione
trascrizionale di geni
responsive all’attacco
patogenico, la produzione di
ROS e la deposizione di
callosio per rinforzare la parete
cellulare nei siti d’infezione
I patogeni di successo reprimono la
PTI
• A cosa servono gli effettori?
– Alcuni possono avere un ruolo strutturale
come ad es. nella matrice extraustoriale che
si forme durante alcune infezioni fungine o di
oomiceti
– Altre possono promuovere un rilascio di
nutrienti o la dispersione del patogeno
– Molti sembrano contribuire attivamente alla
repressione di una o più componenti della PTI
o dell’ETI (alcuni eff. Influenzano sia l’una che
l’altra)
Effettori di fitopatogeni
Effettori di virus fitopatogeni
• Uno dei meccanismi principali attraverso i quali le piante si
difendono dai virus è l’RNA silencing che regola l’accumulo di
molecole di RNA endogeno ed estraneo. Un potente stimolo
per l’RNAs è la presenza di RNA a doppio filamento
• La maggior parte dei virus vegetali hanno genomi a RNA e
strutture a doppio filamento secondarie o come intermedi
replicativi possono stimolare il silenziamento dell’intero
genoma virale prevenendo la diffusione sistemica
dell’infezione
• I determinanti della virulenza virale, in pratica degli effettori
virali, possono reprimere il silencing
• Differenti soppressori possono interferire con componenti
unici del macchinario del silenziamento suggerendo che molti
virus possono aver sviluppato questo sistema
indipendentemente
• A loro volta le piante usano un meccanismo secondario di
difesa per riconoscere e restringere i movimenti dei virus.
Specifiche R proteins riconoscono dei componenti virali
(soppressori di silencing o altre proteine)
Riconoscimento diretto ed indiretto
degli effettori
• Gli effettori che consentono al patogeno di evitare la PTI
sono riconosciuti dai prodotti di specifici geni di
resistenza
• La maggior parte dei geni R codifica per proteine NBLRR, ce ne sono 125 in Arabidopsis
• Basta che un effettore sia riconosciuto da una proteina R
per far attivare la ETI
• L’effettore che viene riconosciuto è denominato come
fattore Avr (di avirulenza)
• La risposta ETI è in realtà una versione più veloce e
forte della PTI che molto spesso culmina nell’HR
• L’HR è limitata al sito d’infezione e può ritardare la
crescita di alcuni tipi di patogeno (biotrofi)
La proteine NB-LRR
• La più grande classe di geni di
resistenza è rappresentata da una
famiglia di proteine che contengono
sempre un nucloetide binding domain
(NB) e un dominio Leucine rich repeat
(LRR)
• Il motivo NB ha omologia con la
regione NB dei regolatori di apoptosi
come CED4 (Caenorhabdtis elegans)
e Apaf-1 (uomo)
• Il dominio LRR è costituito tipicamente
da 20-30 AA e si trovano in tutti gli
organismi viventi. I domini LRR sono
soggetti a selezione diversificante e
grazie alla loro ipervariabilità
governano la specificità di
riconoscimento.
• Le NB-LRR si dividono in 2 categorie
– CC (coiled coil)-NB-LRR
– TIR (Toll-interleukin1-receptor)-NBLRR
La proteine NB-LRR
• Una altra principale classe di R genes
codifica per proteine extracellulari LRR
(eLRR)
• 3 sottoclassi di eLRR sono state
classificate in base alla struttura dei
loro domini
– RLP (receptor like proteins):costituite
da un dominio extracellulare LRR e
uno transmembrana TM
– RLK: LRR+TM+ un dominio kinasico
citoplasmatico
– PGIP (polygalacturonase inhibiting
proteins): dominio LRR in parete
• Le eLRR meglio caratterizzate sono i
fattori Cf che conferiscono al
pomodoro resistenza contro C. fulvum
La proteine NB-LRR
• Una nuova classe di R genes codifica
per proteine TIR-NB-LRR che
contengono anche un peptide segnale
di localizzazione nel nucleo e un
dominio di attivazione trascrizionale
WRKY come RRS1-R che conferisce
resistenza a Ralstonia solanacearum
• Recentemente è stata trovata in riso
una proteina R, Xa27, che non ha
alcuna omologia con le altre classi di R
proteins e che conferisce resistenza a
X. Oryzae che esprime AvrXa27
• Questa proteina si esprime
esclusivamente nelle cellule vicine al
sito d’infezione, fornendo il primo
esempio di espressione differenziale a
livello tissutale di una R protein
Evoluzione e selezione delle
proteine R
• Diversi geni NB-LRR sono sottoposti a splicing
alternativo, in tal modo si generano varianti che
codificano per proteine similari ai geni R troncati presenti
normalmente nel genoma
• Il gene TIR-NB-LRR di tabacco che riconosce il TMV
altera la relativa abbondanza di varianti di splicing
durante l’infezione virale
• Diverse R proteins agiscono in complessi multiproteici
che mediano l‘interazione con gli effettori del patogeno e
inducono il signalling difensivo
• L’evoluzione dei geni R potrebbe essere facilitata dalla
formazione di cluster di geni R, questo permetterebbe un
continuo scambio di sequenze attraverso un mispairing
ricombinativo generando cosi un’elevata diversità
aplotipica
Evoluzione e selezione delle proteine R
• Recenti evidenze suggeriscono che la
ricombinazione nei cluster R viene incrementata in
seguito a infezione patogenica suggerendo un
meccanismo che induce una instabilità genomica
temporanea in risposta e forti stress come l’attacco
di un patogeno
• In assenza della pressione del patogeno, la
ricombinazione e l’attività dei trasposoni nei clusters
R è inibita presumibilmente attraverso una
modificazione della cromatina
• In tal modo scambi di sequenze e quindi la loro
omogenizzazione viene limitata, i paraloghi dei geni
R sono diversificati per mutazioni puntiformi e i geni
R funzionali e gli aplotipi vengono conservati
Evoluzione e selezione delle
proteine R
• In seguito a stress biotico dovuto ad un patogeno che riesce ad
evitare le difese dell’ospite, una riduzione della metilazione
risulta in un incremento della ricombinazione che persiste per
diverse generazioni facilitando eventi di rimodellazione
cromosomica come la duplicazione/perdita di geni e la
generazione di geni chimerici attraverso lo scambio di sequenze
• L’assenza di stress attraverso l’evoluzione di una resistenza
funzionale o attraverso la separazione ecologica dal patogeno
induce nuovamente la stabilità nel genoma
• Un pattern di metilazione differenziale in alcuni regioni del
genoma anche in assenza di stress potrebbe consentire continui
fenomeni di ricombinazione nei R clusters, generando in tal
modo una riserva di sequenze che potrebbe codificare proteine
NB-LRR pronte a rispondere a patogeni ancora non incontrati
(universo idiotipico?)
Co-evoluzione dei geni R e dei
complementari effettori patogenici
• L’efficacia dell’ETI seleziona delle varianti microbiche che possono evitare
il riconoscimento di un particolare effettore mediato dalle proteine NB-LRR
• Quindi la sua frequenza allelica sarà influenzata, in pratica, dalla sua
modalità d’azione
• L’alto livello di selezione diversificante presenti nei geni che codificano per
gli effettori è probabilmente legata e selezionata dal meccanismo di
riconoscimento effettuato dall’ospite
• I geni che codificano per gli effettori sono spesso associati ad elementi
genetici mobili o ai telomeri
• L’ETI può essere quindi resa inefficace mediante una continua
diversificazione degli effettori ma anche attraverso la comparsa di effettori
capaci di reprimerla
• Ad esempio in P. syringae AvrPphC reprime l’ETI stimolata da AvrPphF
agendo quindi da fattore di virulenza
L’arms race rispiegata…
1.
2.
Un patogeno possiede un gene
codificante per un effettore
(E1) riconosciuto dal prodotto
di un allele raro R1 dell’ospite
Questo risulta nella selezione
di R1 per l’aumento della sua
frequenza allelica nella
1
popolazione dell’ospite
•
3.
a questo punto il patogeno che
esprime l’effettore E1 viene
riconosciuto dall’ospite e la sua
crescita inibita
I patogeni in cui E1 è mutato o
“abbandonato” vengono
selezionati dato che sono gli
unici che riescono a crescere
sull’ospite contenente R1
2
3
4.
L’efficacia di R1 viene erosa
(dato che E1 è in bassa
frequenza) e dato che
l’espressione di un pattern di
difesa ha dei costi in termini di
fitness, le piante che hanno R1
hanno una fitness ridotta
•
•
5.
6.
Questa risulta in una ridotta
frequenza di R1 nella
popolazione.
La popolazione del patogeno
ancora contiene individui con E1
In assenza di R1, E1 conferisce
un aumento di fitness al
patogeno e la sua frequenza
nella popolazione ricomincia a
crescere
Questo porta a “riesumare” R1 e
il ciclo riprende….
6
5
4
Regolazione delle proteine NB-LRR
• Le proteine NB-LRR sono mantenute in un folding “segnale
competente” grazie a hsp90 o ad altre chaperonine
• Il dominio LRR agisce come regolatore negativo che
previene un’attivazione inappropriata del dominio NB
• Questo suggerisce che almeno in parte le proteine R siano
regolate negativamente
• L’attivazione di NB-LRR coinvolge dei cambiamenti
conformazionali inter ed intra-molecolari che assomigliano ai
cambiamenti che subisce il fattore Apaf-1 che attiva la PCD
nelle cellule animali
• L’associazione del CC domain con NB richiede la presenza
di un dominio NB funzionale anche se lo stato
(attivo/inattivo) dello stesso dominio non influenza le
interazioni proteina-proteina del dominio LRR
• Questo ci suggerisce che NB sia “solo” il controllore delle
interazioni tra i domini strutturali delle R proteins
Attivazione delle proteine NB-LRR
• L’attivazione delle proteine NB-LRR risulta in un
complesso cross-talk tra le diverse risposte di
difesa verso i patogeni biotrofi o necrotrofi
• Questo tipo di specificità è mantenuto da un
preciso bilancio tra l’acido salicilico (SA),
segnale locale e sistemico contro i biotrofi, e una
combinazione di acido jasmonico (JA) e di
etilene (ET) il cui accumulo agisce come
segnale per attivare la difesa contro i necrotrofi
• Mutanti di Arabidopsis difettivi nella biosintesi o
nella ricezione di SA manifestano alterazioni sia
della resistenza basale che di quella sistemica
• In particolare, molte proteine NB-LRR attivano in
modo differenziale le risposte indotte dal SA o
dai ROS a livello locale o sistemico
..e disattivazione
• È stato dimostrato che RPM1 (NB-LRR) “scompare”
durante l’infezione con batteri che rilasciano nella cellula
AvrRpm1 o AvrB
• Questa degradazione avviene probabilmente attraverso il
proteasoma
• Un ruolo per il proteasoma nel funzionamento delle NBLRR è stato dimostrato attraverso la perdita di
funzionalità della R protein N, in piante di tabacco
silenziate per componenti del signalosoma COP9
• COP9 è un regolatore chiave del funzionamento della
pathway di degradazione delle proteine in tutte le cellule
• Se le piante degradano le R proteins in seguito ad
attivazione è possibile che l’attivazione sia accoppiata
alla degradazione delle proteina R per limitare la durata
della loro attività come avviene in alcuni fattori di
trascrizione umani
• La chaperonina HSP90 citosolica è stata implicata anche
nella distruzione proteasoma-mediata di proteine R
• Nelle cellule animali in assenza di HSP90 i recettori per gli
steroidi non possono legare gli ormoni e sono degradati nel
proteasoma.
• In presenza di HSP90 e di ormoni steroidei i recettori si
attivano. In seguito all’attivazione però, questi recettori sono
degradati attraverso il proteasoma.
• Facendo operare entrambi i sistemi (attivazionedegradazione) attraverso HSP90 la cellula ha un
meccanismo che accoppia la formazione di un complesso
funzionale recettore-ligando al meccanismo di degradazione
• Questo sistema fornisce un preciso meccanismo per limitare
gli effetti di una attivazione spontanea dei recettori, che nel
caso delle R proteins, risulta essere letale per la cellula
stessa (molti fattori R controllano la PCD)
Meccanismo di attivazione/degradazione
• Come fa HSP90 a funzionare da link
molecolare tra l’attivazione delle NBLRR e la loro degradazione attraverso
il proteasoma?
• Interagendo con RAR1 e SGT1
• RAR1 è una gene comune nella
resistenza a diverse razze di B.
graminis nell’orzo che codifica per
una piccola proteina che contiene due
domini di legame con lo zinco
• Questo dominio di interazione
proteina-proteina di 60AA è
denominato CHORD (cysteine and
histidine-rich domain (CHORD)containing, zinc-binding protein 1) è
comune a molte proteine animali
coinvolte nel meccanismo di
degradazione proteica
Meccanismo di attivazione/degradazione
• SGT1 che è una componente del
complesso SCF (E3 ubiquitina ligasi –
proteasoma) in Arabidopsis è
richiesta per la resistenza contro
almeno 4 isolati di Peronospora
parasitica
• RAR1 e SGT1 interagiscono in vivo e
funzionano da punti di convergenza in
numerose pathway di resistenza alla
malattia
• Quindi le proteine HSP90
– formano dei complessi contenenti R
proteins mantenendoli in una
conformazione attiva
– mediano le interazioni tra queste e il
proteasoma attraverso RAR1 e SGT1
• Dopo l’attivazione della disease
pathway l’HSP90 induce la
degradazione della proteina NB-LRR
mediante SGT1
Receptor oligomerization
• Il riconoscimento dell’effettore
induce cambiamenti
conformazionali nelle NB-LRR
associati con uno scambio di
nucleotidi nel dominio NB.
Questo espone il dominio
segnale N-terminale per
attivare la risposta downstream
• La proteina NB-LRR «M» è
accesa quando lega l’ATP e
spenta con l’ADP
• Una volta attivate alcune
proteine NB-LRR (vedi Flax
L6) dovrebbe oligomerizzare i
domini segnale per attivare le
risposte downstream
Le proteine NB-LRR e la guard
hypothesis
• Molte proteine NB-LRR riconoscono degli
effettori di tipo III indirettamente determinando il
prodotto della loro azione sui bersagli dell’ospite
piuttosto che l’effettore stesso
• I principali punti della guard hypothesis sono:
– Un effettore agendo come fattore di virulenza ha un
suo target nell’ospite
– Manipolando il suo bersaglio l’effettore contribuisce al
successo del patogeno nello stabilire una reazione
compatibile
– La perturbazione che l’effettore provoca sul bersaglioospite genera un pattern molecolare pathogeninduced modified self in grado di attivare la
corrispondente NB-LRR e di scatenare l’ETI
..conseguenze
• Esistono 3 importanti conseguenze
sperimentali questo modello:
– Molteplici effettori possono essersi evoluti
indipendentemente ma riuscire ad alterare gli
stessi bersagli cellulari
– Questo ha portato all’evoluzione di più di un
fattore NB-LRR associato ad un target di più
effettori (i.e. lo stesso NB-LRR per diversi
effettori)
– Queste NB-LRR saranno quindi attivate dal
riconoscimento di differenti modified selfpatterns prodotti sullo stesso target dall’azione di
diversi effettori
..esempio 1
• RPM1 di Arabidopsis è una proteina NB-LRR che si trova sul lato citosolico
della membrana cellulare attivata dagli effettori AvrRpm1 e AvrB di P.
syringae
• AvrRpm1 aumenta la virulenza di P. syringae in Arabidopsis cosi come
AvrB in soia (G. max)
• AvrRpm1 e AvrB sono modificati da un sistema di acilazione eucariotico
una volta rilasciati nella cellula dal sistema di secrezione di tipo III e quindi
sono così indirizzati alla membrana cellulare
• Il loro target è RIN4 (una proteina di membrana acetilata) che viene
fosforilato, inattivandosi. La sua fosforilazione attiva RPM1
..esempio 2
• RPS2 è una NB-LRR localizzata in membrana che è attivata da AvrRpt2
• AvrRpt2 è una cisteina proteasi (eff. Tipo III) di P. syringae che possiede un
sito di miristoilazione (dominio idrofobico) eucariotico che la indirizza verso
la membrana dell’ospite
• AvrRpt2 è il terzo effettore che ha come target RIN4. Infatti questo fattore
taglia RIN4, inattivandolo. Questo taglio porta all’ETI mediata da RPS2
• In assenza di RPS2 AvrRpt2, svolgendo la sua azione idrolitica su RIN4 e
altri fattori, contribuisce alla virulenza di P. syringae
..esempio 3
• RPS5 è una NB-LRR localizzata in membrana attivata da AvrRphB, una
cisteina proteasi (eff. Tipo III) di P. syringae
• Questa possiede un sito di acilazione eucariotico che potrebbe indirizzarla
verso la membrana
• AvrRphB taglia PBS1 una serina-treonina kinasi, inattivandola. Questo
taglio porta all’ETI mediata da RPS5
• L’attività catalitica di PBS1 tagliata è necessaria all’attivazione di RPS5,
suggerendo che questo frammento di modified self mantenga la sua attività
enzimatica come parte del meccanismo di attivazione di RPS5
..esempio 4
• Pto è una serina-treonina kinasi di pomodoro
• L’attività di Pto richiede la proteina NB-LRR Prf con cui forma
un complesso molecolare
• Pto è il target di AvrPto e AvrPtoB (P. syringae) e quindi Prf
controlla il corretto funzionamento di Pto, altrimenti scatena
l’ETI
..esempio 5
• La proteina transmembrana RLP Cf-2 controlla
l’attività della cisteina-proteasi Rcr3 in pomodoro
• Avr2 di Cladosporium fulvum codifica per un inibitore
di cistein-proteasi (Rcr3)
• Quindi Cf2 dovrebbe controllare lo stato di Rc3 e
attivare la difesa quando Rcr3 è inibito da Avr2
..esempio 6
• L’emibiotrofo Colletotrichum higginsianum produce
una serie di effettori relativi a proteine che legano la
chitina che pososno funzionare per inibire la PTI
The decoy model
• Tra i meccanismi indiretti di
riconoscimento la pianta
può usare delle proteine
«esca» (decoy) evolute per
mimare i target degli
effettori
• La pianta quindi creerebbe
dei falsi target «ad hoc» per
«confondere» gli effettori
• L’evoluzione indipedente di
«mimi» molecolari potrebbe
risultare in un’esca
esclusivamente coinvolta
nella percezione
dell’effettore
Vantaggi del modello «esca»
•
•
•
•
Forze selettive contrarie operano
sui target «bona fide» degli
effettori (TE)
In assenza della R protein i TE
sono sotto pressione selettiva per
ridurre l’interazione ed evadere la
manipolazione da parte degli EF
In presenza di una R protein il TE
sarà invece sotto una pressione
selettiva per favorire l’interazione
con l’EF ed aumentare la
percezione del patogeno
La presenza di un decoy ridurrà la
«costrizione» evolutiva imposta
sul TE consentendogli (al decoy)
di specializzarsi come corecettore
che regola l’attivazione delle R
protein
..comunque
• Non tutti i fattori NB-LRR agiscono per
riconoscimento indiretto, esistono almeno
2 esempi di interazione Avr/NB-LRR
diretta:
– RRS1-R, è una proteina che conferisce
resistenza ai ceppi di Erwinia spp. che
producono PopP2, un effettore che ha come
bersaglio il nucleo della cellula ospite
– Il locus L di lino codifica per una NB-LRR che
interagisce con AvrL. Sia L che AvrL si
trovano in arms race
..dopo l’attivazione
• Ci sono almeno 3 vie che
indipendentemente portano ad una
riprogrammazione trascrizionale in
seguito all’attivazione della difesa
• La prima è legata ai geni EDS1
(enhanced disease susceptibility) o
PAD4 che interagiscono fisicamente
tra loro in vivo
• EDS1/PAD4 interagiscono
principalmente con le proteine CCNB-LRR
• La riprogrammazione trascrizionale
seguente al riconoscimento del
patogeno è dipendente
dall’accumulo a livello nucleare di
EDS1
NDR1
• La seconda è legata a NDR1 (non
race specific disease resistance)
che codifica per una
glicosilfasfatidilinositolo(GPI)
anchored protein
• Negli animali queste proteine si
trovano nei rafts lipidici
(specialised membrane domains
enriched in certain lipids
cholesterol and proteins ) e sono
associate con complessi
recettoriali.
• NDR1 interagisce principalmente
con le proteine TIR-NB-LRR (ad
es. interagisce con RIN4 e con
RPM1)
RPW8
• Una terza via è
rappresentata dai geni R
RPW8 1 e 2 che
conferiscono resistenza
a numerose powdery
mildews (oidio) e
codificano per delle
proteine con domini CC
ma senza le regioni NB
e LRR
Ricapitolando….
• Dopo la percezione dei PAMP del patogeno o dopo un
interazione avr/R si depolarizza la membrana e si ha un
efflusso di ioni Ca con attivazione di calmoduline/calmoduline
kinasi e canali ionici di membrana
• Questi fattori contribuiscono all’attivazione della NADPHox
(burst ossidativo) e di altre cascate MAP kinasiche nonché
all’attivazione della NO sintasi
• Queste pathway contribuiscono indipendentemente o
sinergicamente all’attivazione dei fattori EDS1/PAD4 o NDR1
• Cosa controllano questi fattori? In primis la sintesi di acido
salicilico, composto ormonale capace di attivare sia la
resistenza locale che sistemica soprattutto contro i patogeni
biotrofici
• L’SA è un potente induttore di risposta trascrizionale
Regolazione genica della difesa
• Un elemento chiave che controlla i cambiamenti di
espressione genica indotti da SA durante la resistenza è
NPR1
• NPR1 è trasportata nel nucleo in risposta all’induzione della
SAR e la sua localizzazione nucleare è necessaria per
l’attivazione delle PR proteins
• NPR1 non sembra agire come un fattore di trascrizione ma
ci sono molte evidenze di una sua interazione con dei fattori
di trascrizione della famiglia TGA-bZIP
• Quindi NPR1 controllerebbe la trascrizione modulando
l’attività dei fattori di trascrizione piuttosto che controllare
direttamente l’espressione genica
I fattori WRKY
• In aggiunta ai fattori TGA-bZIP membri di una famiglia di
fattori di trascrizione tipici delle piante, i fattori WRKY,
agiscono sia a monte che a valle di NPR1, infatti
l’espressione del gene che codifica per NPR1 stesso è
controllata da questi fattori
• Mutazioni nei WRKY responsive elements nel promotore
di NPR1 risultano in una riduzione della resistenza basale
• Comunque il ruolo a valle di NPR1 dei fattori WRKY è
dimostrato dal fatto che molti geni responsive a NPR1 e
più in generale attivati durante la SAR, posseggono nel
loro promotore dei WRKY-RE
• Quindi un meccanismo generale della SAR mediata da
NPR1 coinlvogerebbe dei fenomeni di derepressione
genica da parte dei fattori WRKY combinata con
l’attivazione genica operata dai TGA-bZIP
Regolazione dei fattori di trascrizione
• Una moltitudine di fattori di trascrizione sono espressi in risposta ad
un’ampia varietà di differenti stimoli correlati alla difesa
• Membri delle famiglie geniche ERF(ethylene response factors), bZIP,
Myb, WRKY cosi come altri fattori che presentano domini zinc finger
sono up-regolati durante le interazioni compatibili ed incompatibili
• Tutti questi fattori di trascrizione che mostrano questa up-regolazione
legata alla difesa si legano ai promotori dei molti geni PR o
comunque correlati ad attività difensive e quindi possono partecipare
alla loro regolazione
• D’altronde l’attività dei fattori di trascrizione può essere direttamente
collegata con il signalling molto più a monte attraverso eventi di
fosforilazione
• Sia i fattori ERF che WRKY possono essere target di protein kinasi
attivate durante la difesa. Ad es. 3 ERF (Pti 4-5-6) vengono fosforilati
da Pto, una serina/treonina kinasi, una R protein di promodoro che
media il riconoscimento di P. syringae
• Il modulo MAPK stimolato da flg22 controlla l’espressione di
WRKY29
Attivazione dei geni legati alla difesa
• I cambiamenti trascrizionali in almeno il
20% del genoma di Arabidopsis sono
associati con la resistenza R-mediata e
basale
• I pattern di espressione genica associati
con una resistenza locale compatibile o
incompatibile sono praticamente uguali
• Le risposte R-dipendenti però sono più
rapide e uno specifico subset di geni
sono indotti con maggiore intensità
• Quindi sottili differenze nel timing e
nell’ampiezza dell’attivazione
trascrizionale piuttosto che profonde
modificazione del trascrittoma possono
spiegare l’efficacia delle risposte Rmediate
• Esisterebbe quindi un meccanismo di
funzionamento comune alla resistenza
R-mediata e a quella basale che
converte un segnale di input (il
patogeno) in un output di espressione
genica in un modo determinato da un
punto di vista quantitativo
Biologia
dell’invasione
• Myosina XI modula le risposte
della cellula ospite e la resistenza
alla penetrazione di patogeni
fungini
• Il rimodellamento del
citoscheletro di actina è pensato
per contribuire alla creazione di
barriere efficaci alla periferia delle
cellule vegetali contro l'ingresso
di funghi
• PENETRAZIONE 1 (PEN1) nelle
papille apoplastiche, contribuisce
all’attenuazione della resistenza
alla penetrazione.