Transcript La DD RT-PCR

La DD RT-PCR
• DDRT-PCR : Differential Display Reverse Transcription Polymerisation Chain Reaction
• Technique basée sur la RT-PCR
• Technique de tri d’ARNm : differential display
• Développée par Liang P. et Pardee A. B. en 1992
• Différences d’expression de gènes entre 2 cellules dans des conditions
différentes
Principe du DD RT-PCR
Cellules A :
AAAAAA
(même principe pour cellules B)
AAAAAA
AAAAAA
Isolation
des ARNm
Hybridation (amorce T12AC) – RT.
GUAAAAAA
CATTTTTT
GUAAAAAA
CATTTTTT
Idem avec d’autres
amorces T12XY.
Hybridation (amorce aléatoire)
Elongation.
NNNNNN
NNNNNN
NNNNNN
NNNNNN
GUAAAAAA
CATTTTTT
GUAAAAAA
CATTTTTT
Idem avec d’autres
amorces aléatoires.
Principe du DD RT-PCR
NNNNNN
NNNNNN
Résultat obtenu après PCR avec
les différentes amorces utilisées.
GUAAAAAA
CATTTTTT
NNNNNN
NNNNNN
GUAAAAAA
CATTTTTT
Electrophorèse sur gel
de polyacrylamide:
amorce 1
A
Excision et clonage :
 gène sous-exprimé
dans B.
B
amorce 2
A
B
amorce 3 etc…
A
B
Excision et clonage :
 gène sur-exprimé
dans B.
Méthodes dérivées
• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR
• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)
• Targeted Display
• Ordered Differential Display (READS)
Méthodes dérivées
• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR
• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)
• Targeted Display
• Ordered Differential Display (READS)
AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily
Primed PCR
RT : amorce oligo(dT)  amorces d’oligonucléotides arbitraires
 ARN qui ne sont pas polyadénylés (ex : bactéries).
 Minimiser amplification région 3’ non codante.
Limite : choix des amorces et abondance des ARN définissent
différenciation finale.
 deux amorces arbitraires risquent d’augmenter l’amplification de
mismatch.
Méthodes dérivées
• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR
• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)
• Targeted Display
• Ordered Differential Display (READS)
DDRT-PCR with Selected Primers
Choix expérimentale d’amorces arbitraires
 Meilleure amplification des ARNm abondamment transcrits.
 Éliminer le maximum de faux positifs.
- Taux de G et C dans l’amorce  diminuer l’amplification d’ARNr et d’ARN
mitochondriaux (dans le cas de la RAP-PCR).
- Cycles PCR à température = 50°C  augmente la sélectivité et la
reproductibilité mais aussi le nombre de bandes .
- PCR avec une seule amorce en 3’  meilleure étude des transcrits très
abondants.
- PCR quantitative  confirmer les différences d’expression.
 Observer les transcrits très abondants au détriment des transcrits
faiblement exprimés.
Méthodes dérivées
• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR
• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)
• Targeted Display
• Ordered Differential Display (READS)
Targeted Display
• Identification de transcrits :
- membres d’une même famille de gènes,
- avec domaines spécifiques,
- avec motifs particuliers.
• RT : amorce oligo(dT)
• PCR : amorce spécifique domaine homologue à une famille de gènes ou
domaine spécifique.
 différences d’expression entre des transcrits à l’origine de
facteurs de transcription à domaine spécifique.
 observer des transcrits à motifs répétés souvent à l’origine de maladies
neurodégénératives (ex : Corée de Huntington).
Méthodes dérivées
• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR
• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)
• Targeted Display
• Ordered Differential Display (READS)
Ordered Differential Display
(READS)
READS = Restriction Endonucleolytic Analysis of Differentially expressed
Sequences
Principe :
Ordered Differential Display (READS)
Ordered Differential Display
(READS)
READS = Restriction Endonucleolytic Analysis of Differentially expressed
Sequences
Principe :
 Meilleure reproductibilité des résultats que DDRT-PCR.
Applications DDRT-PCR
 Visualiser des différences d’expression de gènes
Exemples :
• Cellules d’organes différents d’un même organisme
 définir gènes spécifiques de chaque organe.
• Cellules dans conditions environnementales différentes:
- température,
- la salinité (pression osmotique),
- la pression des gaz (O2, CO2 …),
- la luminosité,
- les nutriments (source d’azote, sucres, acides aminés, molécules
pharmaceutiques …),
- etc.…
 définir gènes spécifiques de ces conditions.
Applications DDRT-PCR
 Visualiser des différences d’expression de gènes
Exemples :
• Cellules en présence :
- pathogène (insecte, champignon, bactérie…)
- symbiose
- blessure
 définir gènes spécifiques.
Avantages et Limites
Avantages :
• Fondée sur PCR :
- peu de matériel  1 µg ARNm poly(A)/échantillon
 150 réactions
- peu onéreuse.
• Identification gènes sur et sous-exprimés sur un même gel.
• Plus rapide que techniques de criblage différentiel.
• Beaucoup de comparaisons entre échantillons grâce à combinaisons
d’amorces différentes.
Avantages et Limites
Limites :
• Saturation pour gènes fortement transcrits  sous estimation de la
bande.
• Beaucoup de faux positifs dans les fragments de PCR clonés : un
problème intrinsèque à la méthode.
• Une bande : plusieurs fragments d’ADNc différents, de même
longueur.