Transcript Haltbestämning av miljögifter i fisk från Östersjön

Haltbestämning av persistenta
organiska miljöföroreningar i fisk
Henrik Carlsson, MMK 2013
Kromatogram
µV
9,000,000
8,500,000
8,000,000
7,500,000
krc-a4.DATA
p,p'-DDD
9,500,000
p,p'-DDE
Efter injektion av prov på gaskromatograf fås ett s.k. kromatogram
där de föreningar provet innehåller har separerats och ses som enskilda
toppar.
y-axeln visar signalstyrkan
7,000,000
6,500,000
6,000,000
CB-153
5,000,000
CB-138
5,500,000
4,500,000
4,000,000
CB-189
500,000
CB-170
CB-156
CB-180
1,000,000
CB-187
CB-183
CB-128
1,500,000
CB-105
p,p'-DDT
HCB
2,000,000
CB-146
2,500,000
CB-118
CB-101
3,000,000
transnonaklor
3,500,000
0
RT [min]
11
11.5
12
12.5
13
13.5
14
14.5
15
15.5
16
16.5
17
17.5
18
x-axeln visar den tid de olika föreningarna detekteras
18.5
19
Externstandard
En lösning som innehåller kända mängder av de analyter vi vill titta på.
CB-138
CB-153
DDE
HCB
m.fl...
CB-189 Internstandard
Kromatogram från externstandard
1,300,000
300,000
CB-189
CB-170
CB-180
CB-199
p,p'-DDT
B-HCH
400,000
CB-118
500,000
CB-52
CB-28
600,000
CB-101
700,000
CB-156
800,000
CB-138
900,000
p,p'-DDD
CB-146
CB-153
CB-105
1,000,000
G-HCH
a-HCH
HCB
1,100,000
CB-187
CB-183
CB-128
krc_a3.DATA
transnonaklor
p,p'-DDE
µV
1,200,000
200,000
100,000
0
-100,000
-200,000
11
RT [min]
11.5
12
12.5
13
13.5
14
14.5
15
15.5
16
16.5
17
17.5
18
18.5
19
Identifiering av föreningar i prov genom jämförelse med
externstandard (kvalitativ analys)
µV
krc-a4.DATA
6,500,000
6,000,000
5,500,000
CB-138
5,000,000
CB-153
4,500,000
4,000,000
Matcha toppar genom att
jämföra retentionstider i
prov och externstandard.
3,500,000
3,000,000
2,500,000
CB-189
CB-180
CB-156
CB-128
CB-170
500,000
CB-183
p,p'-DDT
1,000,000
CB-105
CB-146
1,500,000
CB-187
2,000,000
0
-500,000
RT [min]
16.2
1,000,000
950,000
16.3
16.4
16.5
16.6
16.7
16.8
16.9
17
17.1
17.2
17.3
17.4
17.5
17.6
17.7
17.8
17.9
18
µV
18.1
18.2
krc_a3.DATA
900,000
500,000
CB-189
CB-170
CB-183
CB-187
CB-138
550,000
CB-146
600,000
CB-153
650,000
CB-105
700,000
CB-180
750,000
CB-156
CB-128
800,000
CB-199
850,000
450,000
400,000
p,p'-DDT
350,000
300,000
250,000
200,000
150,000
100,000
50,000
0
-50,000
-100,000
-150,000
RT [min]
16.2
16.3
16.4
16.5
16.6
16.7
16.8
16.9
17
17.1
17.2
17.3
17.4
17.5
17.6
17.7
17.8
17.9
18
18.1
18.2
Haltbestämning
Haltbestämning benämns kvantifiering eller kvantitativ analys.
Signalen för en viss förening är proportionell mot dess mängd i provet.
För att utföra haltbestämningen ska vi återigen jämföra
kromatogrammet för provet med det från externstandarden.
Innan haltbestämningen kan göras måste två begrepp förklaras:
Internstandard och Responsfaktor
Syftet med internstandarden
Internstandarden kompenserar för förluster av analyter i de olika stegen.
µV
krc-a4.DATA
p,p'-DDE
9,500,000
9,000,000
8,500,000
p,p'-DDD
Tillsats av IS
8,000,000
7,500,000
7,000,000
6,500,000
6,000,000
5,500,000
CB-153
4,500,000
CB-138
5,000,000
4,000,000
3,500,000
500,000
CB-189
CB-180
CB-156
CB-170
CB-183
CB-187
CB-128
CB-146
1,000,000
p,p'-DDT
HCB
1,500,000
CB-118
CB-101
2,000,000
transnonaklor
2,500,000
CB-105
3,000,000
0
RT [min]
11
11.5
12
12.5
13
13.5
14
14.5
15
15.5
16
16.5
17
17.5
18
18.5
19
Ingen uppreningsmetod är perfekt och efter varje steg kan vi förvänta oss förluster.
Internstandarden beter sig på samma sätt som analyterna och förlusterna bör vara
de samma.
Vi vet hur mycket av internstandarden som fanns i provet från början.
I haltbestämningen relaterar vi därför alla analyter till halten tillsatt internstandard.
Internstandarden i kromatogrammet
µV
krc-a4.DATA
6,500,000
6,000,000
5,500,000
CB-138
5,000,000
CB-153
4,500,000
4,000,000
3,500,000
Internstandarden!
3,000,000
2,500,000
CB-189
CB-180
CB-156
CB-128
CB-170
500,000
CB-183
CB-187
p,p'-DDT
1,000,000
CB-105
1,500,000
CB-146
2,000,000
0
-500,000
RT [min]
16.2
16.3
16.4
16.5
16.6
16.7
16.8
16.9
17
17.1
17.2
17.3
17.4
17.5
17.6
17.7
17.8
17.9
18
18.1
18.2
Responsfaktor
Olika föreningar detekteras olika bra av detektorn i gaskromatografen, de
har olika respons.
µV
krc_a3.DATA
750,000
500,000
CB-183
CB-187
CB-138
550,000
CB-146
600,000
CB-153
650,000
CB-105
700,000
CB-189
CB-128
800,000
CB-170
850,000
CB-199
Samma koncentration, olika respons.
900,000
CB-180
950,000
CB-156
1,000,000
450,000
400,000
p,p'-DDT
350,000
300,000
250,000
200,000
150,000
100,000
50,000
0
-50,000
-100,000
-150,000
Kromatogram från externstandard.
16.2
16.3
16.4
16.5
16.6
16.7
16.8
16.9
RT [min]
17
17.1
17.2
17.3
17.4
17.5
17.6
17.7
Måste kompensera för detta vid haltbestämningen.
Beräkna responsfaktorer för varje enskild förening!
17.8
17.9
18
18.1
18.2
Beräkning av responsfaktor
Beräknas från externstandarden enligt:
fx

a x  m is
m x  a is
ax = Arean av POM i standard
ais = Arean av IS i standard
mx = Koncentration av POM i standard (ng/ml)
mis = Koncentration av IS i standard (ng/ml)
fx = Responsfaktor
Exempel (CB-138):
fx= (ax x mis)/(mx x ais) =
= (12674 µVxmin x 5 ng/ml)/(5 ng/ml x 16436 µVxmin) =
= 0,77
Responsfaktorn för CB-138 är 0,77. Detta upprepas för samtliga
identifierade föreningar i provet som ska haltbestämmas.
Haltbestämning av förening i prov
Mx 
A x  M is
f x  A is
Ax = Arean av POM i prov
Ais = Arean av IS i prov
Mx = Mängd av POM i prov (ng)
Mis = Mängd av IS i prov (ng)
fx = Responsfaktor TIDIGARE BERÄKNAD!
Exempel (CB-138):
Mx = (Ax x Mis)/(fx x Ais) =
= (91558 µVxmin x 4 ng)/(0,77 x 10850 µVxmin) =
= 44 ng
Halten CB-138 i vårt prov är 44 ng.
Upprepa för varje förening som ska haltbestämmas!
Rapportering av resultat
När resultat rapporteras behöver man ofta relalatera mängden till något.
I detta fall är det mest lämpligt att ge resultatet som mängden av
föreningarna per milligram extraherat fett.
I detta fall har vi 60 mg fett.
Exempel:
44 ng/60 mg fett = 0,73 ng/mg fett
Anges resultatet på detta sätt är det lättare att tolka siffrorna och jämföra
med värden från andra studier.