Transcript 5.supercoiling_copia..

DNA in bacteria
1963 – R. Dulbecco and M. Vogt
discover that the double stranded
DNA of the Polyoma Virus exists
in a closed circular form
Today – it is generally accepted that the
ccDNA is the typical form of
bacterial DNA and cytoplamatic
DNA in animals.
The Nobel Prize in Physiology
or Medicine 1975
In bacteria
Right-handed (negative)
superhelix
Left-handed (positive)
superhelix
Circularly closed DNA genome
Well known effect for the long time phone speakers
Chromatin fibers
Shao lab. University of Virginia
In Eukaryotic cells
It’s matter of scale
The nucleosome
Manca roba
DNA circolare rilassato
superavv. solenoidale
superavv. plectonemico
Il DNA superavvolto può essere di tipo solenoidale o plectonemico (intrecciato)
A knotted situation
Victoria Skeen, University of North Carolina and Chapel Hill
How does the cell succeeds
to solve such a situation?
Topoisomerase II
Topoisomerases
The tailor
of the cell
Wang’s lab 1996
In virus capsid-highly packed
10 mm long
linear DNA
is packed in
a 40-50 nm
size box
Bustamante
Steve
Harvey Lab.Lab. Berkeley
How do we describe the topology of ccDNA?
Linking Number
If the ends of the
double helix are
brought together,
the # of times W
passes around C
is a Topological
constant, which
cannot be changed
without cutting the
strands.
This number is called
LINKING NUMBER
Pulling the two strands
apart without nicking them,
the number of crossings
does not change
Il numero di Linking
1
-1
2
-2
Definizione: È il numero di volte che una catena di DNA è connessa ad un’altra in
modo tale che se voglio disconnetterle devo rompere un legame covalente.
Da una proiezione (come quelle sopra) si ottiene Lk sommando algebricamente il
numero degli incroci (con il loro segno) e dividendo per 2. La somma algebrica
serve a contare in modo appropriato gli incroci “veri” e distinguerli dalle
sovrapposizioni della proiezione.
+
+
-
-
Computing the linking number
+
+
-
-
With six positive
crossings and two
negative crossings,
these curves have
linking number two.
Il numero di Linking
Lk0 = 20
Il numero di Linking di due curve nello spazio è:
• indipendente dalla proiezione scelta (è una proprietà topologica delle curve e non
della proiezione spaziale scelta);
• Invariante per deformazioni continue delle curve, a meno che una delle curve non sia
tagliata: è definito solo per DNA covalentemente chiusi. Lk è invariante se le due curve
sono costrette su un piano o superavvolte nello spazio;
•Lk è sempre intero, siccome due curve possono essere connesse l’una all’altra solo un
numero intero di volte;
• Il segno di Lk cambia se l’orientazione di una delle curve è invertita;
• l’operazione di riflessione rispetto ad un piano di simmetria genera due curve con Lk
invertito di segno.
1
-1
2
-2
-1
c1
-1
e
c2
Matematicamente, Lk può essere calcolato mediante l’integrale di Gauss:
Lk 
1
e  (T 2  T1)
ds1ds2

2
4 C 1C 2
r
in cui: r la distanza che congiunge un punto x sulla curva C1 orientata e y sulla curva
C2, T1 e T2 i versori tangenti in x e y, e è il versore lungo la direzione y–x e ds1 e ds2
gli elementi 
di arco su C1 e C2.
T2 X T1 : vettore perpendicolare al piano T2 T1 sul loro vertice, con verso secondo la regola della mano destra, quindi
equivale ad una rotazione
e. (T2 X T1) la proiezione di e sul vettore T2 X T1 quindi equivale alla combinazione di una rotazione con una tranlazione: un
elica!
Il numero di Linking del DNA rilassato
Lk0 = Tw0
Lk° è N/h, dove N è il numero delle basi e h le basi/spira,
Il numero di Twist del DNA
È il numero di volte che una catena si avvolge sull’altra. questo
numero è positivo se l’elica è destrogira, negativo se è
levogira.
Il Twist (Tw) non è necessariamente un numero intero, e nella
maggior parte dei casi non lo è.
Generalmente, il Tw può essere definito tramite
vettori ruotanti che puntino da una curva C1 all’altra
C2. Per due curve che si avvolgono lungo un asse
rettilineo, Tw è pari all’angolo di rotazione dei
vettori diviso per 2π.
In generale il Tw può non essere intero e cambia
a seguito di deformazioni della curva C1 o della
superficie che collega C1 a C2.
Il numero di Writhe
È il numero di volte che l’asse dell’elica si avvolge su se stesso nello spazio. Il writhe
(Wr) dipende solamente dalla traiettoria dell’asse della doppia elica nello spazio, non dal
fatto che il DNA abbia 2 eliche avvolte l’una sull’altra.
Wr non ha necessariamente un valore intero. Se la traiettoria del DNA giace su un
piano, Wr è sempre 0. Wr=0 anche se la traiettoria del DNA giace su una superficie
sferica.
Come mostrato in una delle diapositive
precedenti, il DNA può avvolgersi nello
spazio in due modi, essenzialmente: se si
avvolge attorno a se stesso lo fa
generalmente nel modo plectonemico
(intrecciato), se si avvolge intorno ad un
oggetto, lo fa in modo solenoidale. In
soluzione il writhe isomerizza tra le due
forme.
Il superavvolgimento da osservazioni al microscopio
I metodi di microscopia ad alta risoluzione permettono di determinare direttamente
la traiettoria dell’asse della doppia elica del DNA nello spazio (o più spesso in un
piano) e seguire il “branching” ove la tensione elastica del superavvolgimento da
vita a strutture plectonemiche ramificate.
Un esempio: TEM di DNA superavvolto (si
possono contare gli incroci ed avere una stima del Wr,
( non si determina il segno di Wr.)
Una immagine AFM di DNA superavvolto (molecola di pBR322,
4361 bp): l’AFM ottiene direttamente informazioni tridimensionali e può
determinare direttamente e semplicemente la traiettoria tridimensionale
dell’asse molecolare della molecola osservata, per poterne calcolare il Wr:
si determina direttamente la chiralità del superavvolgimento.
Computing the writhing number
+
+
crossing
+
-
-
-
Il calcolo del Wr per una molecola osservata
Con il metodo dei writhing delle
proiezioni, considerando tutte le
possibili proiezioni di questa
curva da tutti i punti di vista
possibili. La figura è quasi piatta,
per cui la maggior parte delle
intersezioni ha Wrp= –2, solo per
alcune Wrp= –1, ad esempio. Il
risultato di una media
approssimata indica che Wr≈ –2.
Anche da immagini AFM di qualità inferiore
è possibile ricavare informazioni sulla
chiralità del superavvolgimento, anche se
operazioni più complesse di analisi di
immagine sono talvolta necessarie (analisi
stratigrafica).
-1
-1
Il numero di Writhing è definito come la media del “writhing direzionale” di una curva su
tutte le possibili proiezioni. Il writhing direzionale si ottiene sommando algebricamente gli
indici assegnati a ciascun incrocio di una curva orientata con se stessa nello spazio, ai
quali sia stato attribuito segno positivo o negativo secondo la convenzione per la quale
si attribuisce segno positivo qualora sia necessaria una rotazione
in senso antiorario per sovrapporre il vettore direzione della curva
sovrastante a quello della curva sottostante attraverso l’angolo più
piccolo possibile nella proiezione.
Esempi di forme superavvolte
toroidalmente e
plectonemicamente con il loro
Writhing approssimato
.
NB al contrario del Linking number non ho due curve indipendenti che si intersecano la cui
direzione può cambiare, nel writing ho punti diversi su un’ unica curva che si avvolge
A differenza di Lk, anche cambiando l’orientazione della curva, Wr resta
immutato in segno; Il metodo di calcolo matematico è l’integrale di Gauss:
Wr 
1
e  T 2  T1
ds1ds2

2
4 C C
r
al contrario del Lk non ho due curve indipendenti che si intersecano la cui direzione
può cambiare, nel Wr ho punti diversi su un’ unica curva che si avvolge e la sua
chiralità non cambia con il punto di osservazione

Con il calcolo dell’integrale di Gauss per
via numerica, rilevando le coordinate
spaziali di tutti i punti sull’asse del DNA
direttamente dall’immagine AFM. Questo
calcolo porta ad una stima di Wr= –1.98.
-1
-1
In bacteria
Il numero di Linking di un DNA superavvolto
L’ introduzione di superavvolgimenti
in una molecola di DNA (svolgimento o
sovravvolgimento dell’elica destrogira
prima della chiusura di una molecola
lineare in una circolare) riduce o
aumenta il numero di giri d’elica
intrappolati dalla chiusura e risulta in un
cambiamento del numero Lk delle
specie circolari.
∆Lk= Lk–Lk° è la differenza di linking o
deficit di linking, che può essere positivo o
negativo. Nel DNA naturale, ∆Lk<0, essendo
questo sottoavvolto rispetto al DNA lineare
Lk = Tw + Wr
∆Lk= Lk–Lk° = ∆ Tw + Wr
= (Lk–Lk°)/Lk° detto differenza di linking
specifica (densità di superavv.)
Nel DNA naturale, = –0.06, in media:
sottoavvolto di un giro di Tw ogni 17 della
doppia elica destrogira.
Il legame tra Tw, Wr e Lk
La relazione fondamentale che lega i tre descrittori del superavvolgimento è:
Lk=Tw+Wr
Che lega una proprietà topologica, il linking (intero), con due proprietà geometriche, il
twisting ed il writhing (interi o frazionari). Per ogni valore di Lk, esiste una distribuzione
di forme all’equilibrio che ripartiscono il Tw ed il Wr in modo differente. Nelle forme a
basso Wr (in valore assoluto), la tensione torsionale è principalmente a carico del twist
dell’elica (l’elica è sotto tensione, con un numero diverso di basi/spira rispetto allo stesso
DNA lineare in soluzione); nelle forme ad alto Wr, la tensione torsionale è scaricata
grazie al superavvolgimento dell’asse dell’elica, mentre localmente il DNA non è
alterato.
∆
∆
∆
∆
∆
∆
∆
∆
∆
Fluttuazioni conformazionali di plasmidi (dsDNA) superavvolti
L’AFM può osservare
campioni in fluido, in modo
che questi siano liberi di
muoversi sulla superficie.
Nella sequenza di
immagini a fianco, lo
stesso gruppo di molecole
sono state osservate
durante un lungo intervallo
di tempo, in condizioni di
adesione diversa sulla
superficie, in modo da
poterne modulare la
dinamica. Si possono
notare le dimensioni dei
loops cambiare.
SFM observation of the dynamics
of supercoiled DNA in solution (2nd part)
Molte tecniche di simulazione al calcolatore sono state utilizzate
per prevedere e quantificare la forma del DNA superavvolto
Simulazione con = –0.06
Come si ripartisce mediamente la tensione fra il Tw ed il Wr?
( 620 giri invece di 660: sottoavvolto del 40/660= 6%)
( tende a superavvolgersi più che a twistarsi)
Dalle osservazioni al microscopio, congiunte a quelle biochimiche si è giunti alla
conclusione che il ∆Lk si ripartisce per circa il 70% in writhing e per il restante 30%
in twisting. Questa ripartizione dipende dal rapporto tra le elasticità torsionale e assiale
del DNA: se costa molta più energia torcere il DNA che piegarlo, allora la tensione
elastica del sottoavvolgimento si scarica soprattutto sul writhe, che consente di
recuperare una torsione di equilibrio; viceversa, se costa molta più energia piegare il
DNA piuttosto che torcerlo, la tensione dell’avvolgimento si localizzerà prevalentemente
a livello di twisting, senza aumentare il writhing (che comporta una piegatura più
accentuata di sezioni del DNA).
Si può prevedere che sezioni del DNA che possono assumere forme curvate, siano
più facilmente localizzate nei “loop” delle forme intrecciate, piuttosto che nei pressi
degli incroci, dove il DNA è più dritto. Si può comunque prevedere che la barriera
energetica per l’interconversione sia piuttosto bassa, probabilmente sotto kT, per cui
possa facilmente avvenire uno slittamento del DNA che, associato al “branching”
consentirà ad un tratto di DNA di essere presente alternativamente in zone di loop o di
incrocio.
Un campione di DNA superavvolto al microscopio:
nella maggioranza delle preparazioni sono
compresenti molecole superavvolte, molecole
circolari “nicked” che restano rilassate e molecole
lineari (la frazione di queste ultime forme aumenta se
il campione viene “maltrattato” perché il DNA sotto
tensione di superavvolgimento è fragile e basta
anche un solo “nick” per permettergli di rilassare il
superavvolgimento).
La misura sperimentale del superavvolgimento:
La scoperta del DNA circolare e superavvolto risale al lavoro di Vinograd del 1963,
avvenuta grazie a studi di velocità di sedimentazione di DNA di polyoma virus.
La mobilità elettroforetica del DNA superavvolto dipende dal grado di superavvolgimento: è
facile, in opportune condizioni, distinguere i vari topoisomeri. La mobilità elettroforetica
aumenta in modo monotono con l’aumento del valore assoluto del numero di Linking.
Questo è dovuto al fatto che topoisomeri dotati di maggiore differenza di linking, hanno
maggiore writhe, per cui sono più compatti. Questo è vero a meno che non avvengano
transizioni conformazionali che alterino lo stress del superavvolgimento.
T2 DNA undergoing electrophoresis: fluorescence
microscopy
Immagini di S. Gurrieri e collaboratori
Una molecola di DNA di T2
durante elettroforesi
L’effetto degli intercalanti:modifico il twist
Un intercalante contiene una struttura planare aromatica, usualmente policiclica, che si può inserire
tra due coppie di basi del DNA. Questo causa uno svolgimento locale dell’elica, che risulta in un
incremento del numero di basi per spira (helical repeat) quindi una diminuzione del twist.
Ad esempio, il Bromuro di etidio lega fortemente il
DNA a doppia catena (ed ha un grande incremento
della fluorescenza quando è legato) ed il legame di
ogni molecola di etidio causa uno svolgimento
locale di 26°.
NH 2
Bromuro di etidio
Br
N
NH 2
C 2H 5
CH3
NH
Cl
N
N(C2H 5)2
Clorochina
Dall’equazione generale ∆Lk= ∆Tw + Wr, un
decremento del Tw corrisponde ad un incremento del
Wr, per cui un aumento della quantità di etidio nel
DNA corrisponderà ad una transizione verso valori
sempre più positivi di Wr. Si noti che la
concentrazione di 1µg/ml utilizzata abitualmente per la
gel elettroforesi satura completamente il DNA di etidio.
Quando una molecola di Etidio Bromuro intercala il DNA l’
helical twist passa da 36° a 10° ed il rise di 3.3 A° sulla
direzione assiale raddoppia. Quando inserisco una molecola
di Etidio ogni 2 coppie di basi, che é il massimo possibile,
quale diventerà la lunghezza massima di un tratto di 100
coppie di basi in struttura B?
50 X 3.3 + 50X 6.6= 495
Quale sarà il numero totale di giri che questo conterrà?
(50 X 36 + 50X10) /360 = 6.4 giri
L’effetto del bromuro di etidio sul DNA superavvolto
+EthBr
Wr=0
Wr<0
+EthBr
Wr=0
+EthBr
Wr>0
Wr>0
Topoisomerasi I
Wr=0
–EthBr
Wr<0
Le topoisomerasi sono enzimi che agiscono sullo stato topologico del DNA, tagliandolo e
ricucendolo. La Topoisomerasi I, ad esempio, rilassa il DNA superavvolto (riduzione del Wr).
Il superavvolgimento da esperimenti di gel-elettroforesi
Per i campioni di DNA superavvolto nativo di tipo circolare (plasmidi), la distribuzione di topoisomeri
è spesso molto stretta ed a valori molto alti, per cui non è facile distinguere su una normale
elettroforesi i vari topoisomeri che costituiscono la popolazione.
pBR322 nativo
Pozzetti
Circolare rilassato
Lineare
Superavvolto
Una corsa elettroforetica di DNA superavvolto con
∆Lk variabile da 0 a 8. Ogni banda contiene DNA
assolutamente uguale (stessa sequenza,
lunghezza e peso molecolare) che differisce solo
per Lk. OC rappresenta DNA “open circular” in cui
le catene fosfoesteree sono state rotte almeno in
un punto di una catena, per cui il DNA può
rilassare, mantenendo una forma circolare.
Una digestione con un enzima di restrizione avente
un sito unico su questo DNA produrrebbe una sola
banda del lineare che in un gel elettroforetico
generalmente migra più velocemente di OC.
Gel elettroforesi + intercalanti
Nel 1975, Keller introdusse un metodo nuovo per caratterizzare il Lk del DNA
superavvolto: l’introduzione di una quantità variabile di bromuro di etidio nel DNA
durante la corsa elettroforetica modifica lo stress del superavvolgimento, in ragione di
N/360, dove  è il numero di molecole di intercalante che si lega per coppia di basi, 
è l’angolo di svolgimento della doppia elica indotto dall’intercalante, N è il numero di
coppie di basi.
Una quantità opportuna di etidio aggiunta al DNA “nativo” (che è molto sottoavvolto e
appare come una sola banda a migrazione veloce) lo svolge parzialmente fino a
ridurre il Wr sì da portarlo in un campo in cui i vari topoisomeri hanno mobilità
visibilmente dipendente dal grado di superavvolgimento.
a b
Lo stesso DNA nativo di SV40 fatto migrare su tre distinti
(simili) gel elettroforetici contententi 0 (a), 0.016 (b) di
etidio bromuro. In (a) si notano solo la banda contenente
tutti i topoisomeri, in (b) i topoisomeri sono stati separati
grazie all’intercalazione.
Se sono contenuti e risolti tutti i topoisomeri da Lk=0 a Lk
nativo, uno può semplicemente contare il valore di Lk.
Un modo per contare ed assegnare direttamente i topoisomeri è l’elettroforesi
bidimensionale,(con aggiunta di intercalante fra le due corse) la cui
introduzione si deve a James Wang
Un esempio reale di elettroforesi bidimensionale con
aggiunta di intercalante per un campione contenente
molti topoisomeri
La risoluzione nella prima
dimensione giunge a
saturazione per topoisomeri
oltre il 18-esimo.
La seconda direzione, con
clorochina, separa i
topoisomeri molto sottoavvolti
Un breve accenno sul comportamento termodinamico del
DNA superavvolto
Il grado di superavvolgimento del DNA dipende dal passo dell’elica (svolgendo l’elica, il
superavvolgimento diviene più positivo). Studiare il superavvolgimento consente di
avere informazioni anche sul passo dell’elica.
Indipendentemente, Wang e Vinograd determinarono il comportamento termico del
DNA superavvolto. Rilassarono aliquote diverse dello stesso campione di DNA
superavvolto a temperature diverse, poi separarono i topoisomeri sullo stesso gel
elettroforetico. Le differenze tra le distribuzioni dei topoisomeri erano dovute al diverso
passo dell’elica al momento del rilassamento. La determinazione quantitativa porta al
risultato che l’elica del DNA si svolge di 0.012° per coppia di basi per °C. Questo
non sembra molto, ma per una molecola di DNA reale di, ad es., 10 kbp il
riscaldamento da 20 °C a 35 °C porta ad uno svolgimento di 5 giri!
In modo analogo fu possibile per Wang misurare il passo dell’elica del DNA in soluzione.
Utilizzando una serie di DNA che differivano solo di poche coppie di basi (es. 11, 25, 36)
Wang misurò il contributo di svolgimento delle basi aggiuntive e
confermò il valore di 10.4 bp/spira determinato in precedenza
dalla cristallografia a raggi X. In seguito, questo valore fu anche
confermato da Klug che ottenne 10.6 bp/spira digerendo con
nucleasi del DNA adsorbito sulla superficie della mica.
DNA tracts adsorbed on an
inorganic surface, show
Dnase I cutting sites with
10.6 bp periodicity in footprinting experiments.
Nature, 286, 573 (1980)
assumed two preferred azimuthal
orientation due to some anchorage
to the surface because of the
melting of the terminals
L’avvolgimento del DNA nel tempo al variare della forza ionica
La dipendenza del
superavvolgimento dalle
condizioni ambientali
 è la densità di superavvolgimento
La dipendenza del superavvolgimento con
la temperatura è tale che
∆/ ∆T=3.1·10-4 gradi-1
Il segno positivo significa che  aumenta,
cioè la doppia elica si svolge, aumentando
la temperatura (una variazione di 30 °C
causa un cambiamento di  di 0.01, il 20%
del livello nativo di superavvolgimento!)
La dipendenza del superavvolgimento dalla forza
ionica è tale che un aumento della forza ionica
porta ad un decremento di  cioè avvolge la
doppia elica. Perché?
∆/ ∆pX+ è positivo e dipende dallo ione che determina il cambiamento. Per gli ioni monovalenti
(Na+, K+, Li+, NH4+) a concentrazioni tra 0.05 e 0.3 M, ∆/ ∆pX+=4.5·10-3. Gli ioni divalenti hanno
un’influenza ancora superiore sul superavvolgimento (talvolta si usa il Ca2+ per preparare DNA a
livello controllato di superavvolgimento positivo.) Perché?
Gli studi sui campioni di DNA circolare isolati dalle cellule mostra che la densità di
superavvolgimento varia anche notevolmente, da –0.03 a –0.1. La distribuzione dei topoisomeri in
natura si descrive bene con una gaussiana. Per un DNA di 5000 bp, ci sono in media da 20 a 30
superavvolgimenti e si determina che in una preparazione sono contenuti circa 10 topoisomeri in
frazioni comparabili. Talvolta, la distribuzione dei topoisomeri nel DNA isolato da cellule è più larga
di quella di equilibrio termico (ligando in vitro il DNA tagliato): si è visto che il grado di
superavvolgimento e la distribuzione dei topoisomeri in vivo dipende fortemente dalla fase
della vita cellulare. Nella fase di crescita logaritmica, la distribuzione dei topoisomeri è più stretta
che nella fase stazionaria.
Le strutture non canoniche del DNA
Strutture come la forma Z-DNA o il DNA
cruciforme possono essere favorite dalla
tensione di superavvolgimento. Nella
elettroforesi bidimensionali a sinistra si
vede il risultato della corsa di un
campione contenente topoisomeri di
pBR322. Si noti come la risoluzione nella
prima direzione si perde per i topoisomeri
oltre il 18-esimo. La seconda direzione,
con clorochina, separa i topoisomeri
molto sottoavvolti. A destra, nel pBR322
è stato inserito un frammento d(GC)16. Si
nota che al topoisomero 18’ c’è un salto
dovuto ad un rilassamento brusco della
tensione di superavvolgimento
causata da una transizione
conformazionale BZ.
Z-DNA
Nella
forma Z
le
purine
sono
sempre
syn.
•
Lo Z-DNA è un’elica sinistrorsa
che si instura in sequenze con
alternanza purina/pirimidina (CGn)
in cui le basi assumono
conformazioni alternate syn/anti.
La forma
anti è
sempre
favorita
nell’A e
B-DNA
Supponiamo che il ∆Lk di un plasmide di 8000 coppie di basi risulti
in elettroforesi essere -40 e che questo ∆Lk, invece di ripartirsi in
Wr ed in ∆Tw, venga tutto riversato in Wr. Se lo stesso DNA transita
dalla forma B alla forma Z su un tratto di venti coppie di basi,
tenendo in considerazione i diversi passi ed il diverso senso di
avvolgimento delle due doppie eliche, calcolare come questa
transizione su venti coppie di basi modifichi il numero di
avvolgimenti di questo DNA e quindi di quanto venga rilasciata la
tensione torsionale?
B 10 bp/giro destrogiro; Z 12 bp/giro levogiri;
20 basi in B sono 2 giri RH in Z 1.6 LH. si svolge per 3.6 giri
Sequenze palindromiche possono
estrudere strutture cruciformi
In modo simile si possono formare le
giunzioni di Holliday
Anche la formazione di cruciformi è un modo per scaricare la tensione del
superavvolgimento del DNA (in modo quantitativamente diverso dalla formazione del
Z–DNA.) Anche questo tipo di transizione si può studiare con le elettroforesi
bidimensionali. Il grado di svolgimento è pari al numero di giri d’elica che subiscono
l’estrusione del cruciforme, poiché nel cruciforme le catene non sono avvolte una
rispetto all’altra.
Il superavvolgimento negativo (ottenuto mediante legame in forma di superelica
sinistrorsa con le proteine) è un modo per immagazzinare tensione elastica che può
essere spesa per svolgere un certo numero di spire d’elica, processo necessario per il
funzionamento degli enzimi che interagiscono con una catena del DNA alla volta (le
polimerasi, ad esempio.