La Medicina Genómica en la Práctica Clínica

Dra. med Laura Martínez de Villarreal Departamento de Genética Facultad de Medicina y Hospital Universitario UANL

Índice

 Bases moleculares  Medicina Genética Vs Medicina Genómica  Variantes genómicas  El Genoma Humano  Pruebas de laboratorio  Contribución del Genoma Humano en Medicina  Aplicaciones  Fortalezas y limitaciones de la medicina genómica

DNA: Soporte de la información genética

Transcripción Replicación

Dogma central

Traducción

La Antigua Genética

 Enfermedades  Cromosómicas: Ganancia o pérdida de un cromosoma o una parte  Ej., Sd. Down, Sd. Turner, Sd. Cri-du-chat  Monogénicas: Mutación de un solo gen  Ej., Fibrosis quística, Sd. Marfán, Fenilcetonuria, Charcot Marie Tooth.

Cariotipo bandas GTG

La Antigua Genética



Estas condiciones:

 Son de gran importancia para los individuos y sus familias.

 Aún agrupadas son raras.

 La mayor parte de la población no está afectada.

 La Genética jugaba un pobre papel en los servicios de salud y la sociedad.

La Antigua Genética



Estas condiciones “raras”:



La atención del paciente genético involucra un reducido grupo de especialistas (médicos genetistas, consejeros genéticos) con involucro ocasional de otros médicos generales o especialistas.

La Antigua Genética



Investigación:

 Hasta hace 20 años la genética no había resuelto preguntas básicas, pero fue de gran apoyo para el desarrollo de herramientas en el laboratorio.

Revolución tecnológica

Obtención de ADN y secuenciación

 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

 Método de secuenciación de Sanger (SAGE).

 Clonación en vectores (BAC ´s, YAC´s) GRANDES CANTIDADES DE ADN

Herramientas moleculares

SECUENCIACIÓN ELECTROFORÉSIS EN GEL A G C T A G C T

CÁNCER NORMAL

Variantes genéticas

 Las variantes tienen dos componentes: “alelos” (genes paterno y materno).

 Cuando la frecuencia de estos es >1% se consideran polimorfismos.

 El término mutación se utiliza cuando hay cambios en ADN que se consideran patológicos (Ej: FQ) o cambios en el DNA recientes (no germinales) N Engl J Med 2010;362:2001-11.

Variación genómica



Los eventos que contribuyen a la variación genómica son:

   Mutaciones puntuales Inserciones/deleciones Re-arreglos estructurales.

N Engl J Med 2010;362:2001-11.

Patogénesis de mutaciones

 Las Ins/Dels y los SNPs pueden conferir riesgo o protección contra enfermedades  Re-arreglos estructurales se asocian a estados patológicos.

 CNV (variable número de copias) se han ido asociando a un mayor número de enfermedades (autismo, esquizofrenia)

Variación Genómica

       SNP ´s (polimorfismos de un solo nucleótido)  Mutaciones presentes en >1% población C>T más frecuentes 1.8 millones 1 cada 800 pb 60 000 SNP ´s MTHFR y DTN BRCA y Ca. de mama

Polimorfismos

 Se han asociado a enfermedades complejas (enfermedad coronaria, DMT2).

 Las enfermedades complejas son multifactoriales: genes y medio ambiente.

 Pueden resultar de variantes comunes y raras.

Epigenómica

 Alteraciones en la expresión génica sin cambios en la secuencia del DNA.

 Ocurren por metilación en sitios CpG.

 Patrones anormales de metilación están asociados a cáncer:   Hipometilación de oncogenes Hipermetilación de genes supresores

Proyecto del Genoma Humano

Metas

 Identificar genes que contribuyen a enfermedades  Tipo de variantes genéticas y su contribución al fenotipo  Desarrollo de pruebas diagnósticas  Entendimiento de la fisiopatología  Desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Ramas de la Biología Beneficiarias del Conocimiento del Genoma Humano

Medicina Bioinformática Biotecnología

Medicina Genómica

Gen Medio ambiente

Medicina Genómica

Genoma

Medicina Genómica

 Interacción entre el genoma y factores no genómicos y su asociación son salud y enfermedad.

 Proporciona nuevas herramientas diagnósticas y terapéuticas para enfermedades multifactoriales  Incorporación de pruebas genómicas o terapéuticas al cuidado diario.

 Ha cambiado el entendimiento de la biología de la mayoría de las condiciones médicas.

Medicina Genómica



Enfermedades:

 Causadas por mutaciones en genes:  Cáncer de colon, cáncer de mama, arterioesclerosis, enfermedad inflamatoria intestinal, Alzheimer, DMT2, etc.  Prevenibles por mutaciones en genes:  HIV (CCR5),  Posiblemente: arterioesclerosis, cáncer, diabetes, otros.

Medicina genómica

    Se han identificado contribuciones genéticas para enfermedades comunes relacionadas con genes de

baja frecuencia y alta penetrancia.

 HNPCC (cáncer de colon) BRCA1 y 2 (Ca. ovario y mama) MODY 1,2,3… (diabetes) Alfa sinucleína (E.Parkinson)

Medicina Genómica

    A nivel de poblaci ón general la principal contribución ha sido la identificación de genes de

alta frecuencia y baja penetrancia

.

ApoE (Alzheimer) Factor V Leiden (trombosis) CCR5 (resistencia a infecci ón HIV/AIDS)

Medicina Genómica

 Conocimiento de predisposición genética permitirá:  Tamiz individualizado  Cambios de estilos de vida individualizados  Terapia pre sintomática: Ej: Ca de colon, hipertensión.

Medicina Genómica



Farmacogenómica:

 Terapias individualizadas basadas en las determinantes genéticas que condicionan respuesta a medicamentos.

 Uso de medicamentos que pudieran ser rechazados por sus efectos adversos.

 Nuevos medicamentos para genotipos de enfermedades específicos.

Métodos de estudio

 Estudios de ligamiento: Familias (haplotipos)  Estudios de Asociación: Casos y Controles  Clonación Posicional  Clonación Funcional.

Herramientas Dx.

 Genética:  Enfermedades Raras: Genes causales  Enfermedades comunes: Genes de riesgo (Historia clínica)  Ambas = análisis de un solo gen o panel ScienceTranslationalMedicine.org 17 July 2013 Vol 5 Issue 194

Herramientas Dx. Molecular

 PCR: Tiempo real, mutación dirigida, metilada, múltiplex.

 Microarreglos: SNPs, RNA, ADN, BACs, Tejidos, oligos.

 MLPA  Secuenciación  Monogénica   Secuenciación de nueva generación WGS

Expresi ón Génica: Microarreglos

 Estudio de patrones de expresión génica.

La cantidad de fluorescencia equivale a la expresi ón del gen

Microarreglo Farmacogenómica

Roche Product CYP 450 Genotyping (drug metabolizing system) From:

Nature Biotechnology

2003 21:959-60

Secuenciación

Proteómica

 Investiga los patrones y niveles de expresión génica en células enfermas las cuales pueden analizarse para construir bases de datos de los perfiles de expresión.

Diagnóstico Molecular Aplicaciones

 Identificación preclínica o pre-sintomática de individuos con una condición hereditaria.

 Bases moleculares de una enfermedad (polimorfismos funcionales o genes modificadores).  Farmacogenómica: determinantes genéticas que influyen en la respuesta a medicamentos.

Primer of Molecular Genomics Mayo Clinic Proc.,

Aplicaciones Clínicas

Pre-Sx Cardiología

 Sd. Hereditarios de arritmia: Brugada, QT-largo.

 Cardiomiopatías: dilatada, hipertrófica, ventricular derecha arritmogénica.

 Enfermedades con heterogeneidad genética.

 Reto diagnóstico de LQTS: 5 genes codificantes de canales iónicos explican el 66% de los casos  Actualmente se utiliza el tamiz ECG.

 Solo el 25% de los electrofisiólogos recomiendan Tx con b bloqueadores en asintomáticos basados en ECG.

Caso

 Caso de un masculino que fallece cuando estuvo a punto de ahogarse. La autopsia revela mutación en

KVLQTI

(canal de potasio).

 La hija con ECG normal. Al inicio no se indica tratamiento.

 El análisis molecular revela que es portadora de la mutación del padre.

 Se recomienda tratamiento que de otra manera no se hubiera indicado.

 Sd . muerte súbita infantil: se asocia a mutaciones en gen de canal de sodio

SCN5A

Bases moleculares ECA

 Polimorfismo D/I (deleción/inserción)  Actividad D > I  Genotipo DD asociado a múltiples trastornos: infarto, enfermedad coronaria, nefropatía diabética, asma.

 No se recomienda aún como prueba de tamiz

Farmacogenómica Cardiología

 Uso de diuréticos en hipertensión:   SNP C825T de la sub unidad b 3 de la proteína G, produce una menor respuesta al Tx con hidroclorotiazida.

SNP del gen de la a - aducina produce mejor respuesta a Tx con diuréticos y mayor riesgo a infarto.

 Se sugiere análisis genómico antes de empezar Tx.

Cardiología

 Respuesta a anticoagulante Warfarina  Influencia de genes:

VKORC1, CYP2C9, GGCX

y

CYP4F2

genes 

Se recomienda buscar mutaciones patógenas

.

 Clopidrogel.  Influenciado por genes metabolizadores (CYP2C9)   No hay recomendación de prueba No respuesta = cambio de medicamento.

Hemocromatosis hereditaria

 Enfermedad monogénica más frecuente  Portadores Hetero: 1/20 , Homo 1/250  Penetrancia variable  Riesgo de Cirrosis (hipertensión portal ), Cáncer 

Gen HFE, diagnóstico y portadores

.

Bases moleculares Hematología

 Factor V Leiden (R506Q) : polimorfismo funcional que influye en un proceso patológico 

Prueba molecular diagnóstica de rutina en estados hipercoagulables

.

 Factor de riesgo para trombosis venosa y embolismo pulmonar.

  20% de pacientes con trombosis venosa profunda 60% de mujeres embarazadas con trombosis  Se recomienda en casos de trombosis:         < 50 años Sitios inusuales Historia familiar Recurrente Mujeres embarazadas Mujeres con AO Familiares con TP < 50 a Mujeres con infarto , fumadoras < 50 años

Pre Sx.

Oncología

 Variación en susceptibilidad a cáncer:  Exposición a aminas aromáticas (tabaco y colorantes)  Enzima destoxificante: N-acetiltransferasa

NAT2

 Gen normal: acetiladores rápidos  Gen mutado: acetiladores lentos  50% de la población son acetiladores lentos y tienen mayor riesgo de cáncer por exposición a aminas

Pre Sx.

Oncología

 Ca colon:  20% : agregación familiar de los cuales 1/3 se asocian a HNPCC o PAF ambas AD 

Pruebas predictivas para familiares: HNPCC y APC

  HNPCC: Inmunohistoquímica de enzimas reparadoras:

hMLH1, hMLH2, MSH6

, e inestabilidad de microsatélites en tumor, y secuenciación en línea germinal.

PAF: Mutaciones germinales de proteína C y electroforesis en gel y análisis de proteína trunca

Oncología

 Ca mama: BRCA1 y BRCA2 riesgo de Ca de mama de 50-85% y de ovario de 15-45%.



Debe tamizarse en mujeres con riesgo: Ca de mama hereditario

.

 La aplicación de pruebas genéticas-genómicas a sujetos asintomáticos depende de la sensibilidad, especificidad y confiabilidad además de costos y accesibilidad.

Indicaciones para Prueba BRCA

 > 18 años  Mujer con Ca de mama / ovario < 45 años  Mujer con Ca de mama/ ovario bilateral o metástasis múltiples.

 Mujer con Ca de mama/ovario a cualquier edad con un familiar de primer grado afectado Dx < 45 años.

 Mujer con Ca de mama /ovario con dos familiares afectados

Bases moleculares Oncología

 Ca mama  

HER-2/neu

(receptor del factor de crecimiento epidérmico) Sobreexpresión en tumores (mama y ovario) es indicador de pobre pronóstico: mayor recurrencia y menor respuesta a Tx.

  Farmacogenómica: Trastuzamab actúa sobre células que sobre-expresan este gen.

BRCA

. Perfiles de expresión (Microarreglos) metástasis y respuesta a tratamiento (Oncotype y Mamaprint)

Oncología

 Linfoma difuso de células grandes (DLBCL):  Perfil de expresión (microarreglos): Identificación dos sub tipos:  Análogo a célula B germinal (mayor sobrevida y mejor respuesta a Tx.)  Análogo a célula B periférica  La constitución genómica de los pacientes con neoplasias malignas modifica la práctica clínica

Farmacogenómica Oncología

 Bases moleculares y Tx específico de:   Leucemia mieloide crónica   t 9 22 Cr. Filadelfia = gen quimérico bcr-abl Actividad de tirosin cinasa = Trastuzumab Leucemia pro mielocítica aguda  t 15 17 altera receptor del ácido retinóico (RAR) impidiendo maduración y muerte de promielocitos.

 Tx- derivados de vitamina A .

Farmacogenómica Oncología

 Tiopurin metil transferasa (TPMT): responsable del metabolismo de Azatioprina  1/300 sujetos no tienen actividad de esta enzima  10% son hipometabolizadores  Responsable de leucopenia en un grupo de paciente Tx con Mercaptopurina.



Se debe buscar el genotipo en pacientes que van a recibir Tx

leucemia) (enfermedad intestinal inflamatoria,

Pre sintomático Gastroenterología

 Familiares de pacientes con: Esofagitis por reflujo, adenocarcinoma de esófago y esófago de Barret: tienen 2X > riesgo de desarrollar la enfermedad  Lo anterior sugiere un factor genético subyacente  Debe vigilarse a los familiares con estas enfermedades  Genes asociados MSR1, ASCC1 y CTHRC en el 11% de casos

Bases Moleculares Gastro

 Esófago de Barret: se están buscando marcadores genéticos de progresión de la enfermedad.

 Progresión de hepatitis C: se asocia a sobreexpresión de genes inmunomoduladores y pro apotóticos.

 Cirrosis biliar hepática: sobreexpresión de genes de vías Wnt y Notch (c-jun, c-myc, c-fos)  Investigación: arreglos de expresión para genes de riesgo de adenocarcinoma hepático, colangiocarcinoma e hígado graso  Colangitis esclerosante y riesgo de cáncer: uso de FISH para aneuploidías en muestras obtenidas por colangiopancreatografía retrógrada (cepillo)

Farmaco Gastro- Psiq

 Crohn – CUCI y resistencia a corticoesteroides:  No expresión del receptor b de glucocorticoides  Gen de resistencia a multifármacos

PG17A

   

CYP2D6:

gen de citocromo asociado al metabolismo de psicofármacos y medicamentos para re-capatación de serotonina afecta la tasa metabólica de los fármacos  W/W= Metabolizadores extensos W/w = Metabolizadores intermedios w/w= Metabolizadores lentos WW/WW= Ultrarápidos  Variación étnica: alrededor del 6.7% son metabolizadores lentos (riesgo de intoxicación)

Estudios de asociación genómica (GWAS)

 Han sido de utilidad proporcionando información sobre el papel de proteínas y vías biológicas en la patogénesis de las enfermedades.

 Las cuales sirven como blanco terapéutico  Sistema de factor de complemento en la degeneración macular  Vía autofágica en enfermedad inflamatoria intestinal

Análisis de SNPs

 Los estudios de GWAS y microarreglos de SNPs permiten analizar la asociación de polimorfismos y condiciones complejas en cohortes.

 La mayoría de los SNPs asociados se encuentran en regiones no codificantes.

 La mayoría de los SNPs asociados con enfermedades comunes aportan una heredabilidad de riesgo del 5 10% 

Actualmente no se recomiendan como marcadores de riesgo para enfermedad en la clínica.

ScienceTranslationalMedicine.org 17 July 2013 Vol 5 Issue 194

GWAS

 Riesgo de GWAS  Hallazgos incidentales  Se deben entregar al médico y si es posible se debe discutir con el paciente desde antes de enviar las muestras para estudio (American College of Medical Genetics (ACMG) ScienceTranslationalMedicine.org 17 July 2013 Vol 5 Issue 194

Enfermedades complejas

 Las enfermedades complejas se deben al efecto conjunto de susceptibilidad genética (poligénica) y factores ambientales.

 La diferencia en riesgo entre portadores y no portadores es mínima  El valor predictivo basado en una sola variante genética no es informativo.

 La predicción de enfermedades complejas debe implicar el análisis simultáneo de múltiples loci : Perfil genético.

 Deben ser establecidos para cada población y actualmente no están aprobados para su uso generalizado.

Enfermedades complejas

 Estudio del valor predictivo de variantes genéticas para el desarrollo de ciertas enfermedades:  DMT2, Enfermedad coronaria, Infarto miocardio, degeneración macular asociada a la edad.  Con excepción de la enfermedad macular asociada a edad e hipertrigliceridemia el valor predictivo de la mayoría de las enfermedades es limitado.

 Enfermedad macular = cinco genes  Hipertrigliceridemia = siete variantes genéticas Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, Review Issue 2

Enfermedades complejas

 Las pruebas de susceptibilidad para enfermedades complejas deben mejorar la predicción establecida por los factores de riesgo convencionales.

 En el caso de DMT2, enfermedad coronaria y cáncer de próstata, las variantes genéticas analizadas no mejoran la predicción comparada con los factores de riesgo clásicos.

 Falta llevar acabo el análisis de un mayor número de Loci 

TCF7L2, Calpain 10, KCNJ11

son los más frecuentemente asociados a DMT2 en la mayoría de las poblaciones

Validación

 Los estudios de predicción debe ser realizados en poblaciones representativas para donde se desean aplicar las pruebas.

 Los estudios de casos y controles se utilizan para ver asociación.  Si se quiere evaluar riesgo y valor predictivo se deben realizar estudios de cohorte a largo plazo y tomando en cuenta factores de riesgo clásicos.

 Los estudios de predicción deben ser validados.

 En el caso de predicción se prefiere la búsqueda de biomarcadores.

Guía para la práctica clínica (CDC)

 Tamiz Neonatal Metabólico  BRCA1/2: Historia familiar  Sd. Lynch (HNPCC): paciente < 50 años, familiares primer grado.  Hipercolesterolemia Familiar.

 HLA para Abacavir.

Guía (CDC)

 Análisis de mutaciones de

KRAS

en pacientes considerados para terapia con anti

EGFR

(Cáncer de pulmón de cel. No pequeñas) Inhibidores de tirosin cinasa (predicción de no reespuesta a cetuximab y panitumumab)  Her2 (Ca mama)  Hemocromatosis

Recordar

 El avance del conocimiento en medicina genómica ha permitido conocer la asociación de genes de riesgo para enfermedades comunes.

 Grupos poblacionales específicos deben ser tamizados para el diagnóstico pre-sintomático.

 La aplicación de la farmacogenómica puede evitar efectos adversos y mejorar la respuesta clínica a los medicamentos. Además de que ha permitido el desarrollo de terapias específicas.

Recordar

 Las herramientas de diagnóstico molecular ayudan en el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades.

 En enfermedades como diabetes y coronariopatías los factores de riesgo clásicos aún tienen mayor poder predictivo.

 Los GWAS no deben hacerse en forma individual si no hay una responsabilidad para la interpretación y evaluación de hallazgos.

 

!

New Genomics Technologies in Prenatal and Postnatal Diagnosis. Dr. Douglas Blake Investigador Clínico de Agilent Technologies

!

 

!

aCGH como Herramienta en el Diagnóstico del Retraso Mental y Síndrome Dismórfico. Dra. Ariadna González del Ángel Instituto Nacional de Pediatría  

!

 

!

The use of NGS for the Identification of New Susceptibility  Mutations to Breast Cancer Dr. Jeffrey Weit Jefe de la División de Genética Clínica del Cáncer, City of Hope. Diagnóstico y Pronóstico Molecular del Cáncer. Dra. María Fernanda Noriega Iriondo Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González”. UANL. Advances in the Understanding of Structural Variation in Cancer Genetics:  Utilization of aCGH in Clinical Testing. Dr. Douglas Blake Investigador Clínico de Agilent Technologies

Enfermedad Locus Gen Cr Prot.

Herencia Edad años

PARKINSON

PARK1 SNCA PARK3 ?

4q21 2p13 a sinucleína ?

AD AD

PARK5 PARK8 LRRK2 PARK2 UCHL Park2

4p14 12q12 6q25 Ubiquitina carboxil hdrolasa Leucine rich repeat cinasa Parkina AD AD AR

PARK6

Pink1

PARK7

Park7 1p36 1p36 Serine threonine K DJ-1 AR AR 46 59 50 35-78 20-40 45-68 variable

Alzheimer

Chromosome # 1q31-q42 14q24.3 19 21q21.2 12



Cellular Protein Presenilin 2 (PS2) Presenilin 1 (PS1) APOE4 Amyloid precursor protein (APP) Gene(s) not identified Function Protease – intramembrane proteolysis Protease – intramembrane proteolysis Major serum protein Membrane glycoprotein ?



Herramientas Dx

 sequence-specific binding of short complementary DNA probes (oligonucle- otides) to DNA samples from patients in order to detect mutations associated with single-gene dis orders. Generally, these assays rely on the poly- merase chain reaction (PCR) to amplify regions of interest in a patient’s DNA; the PCR product is then analyzed for the presence or absence of mutations. New approaches, including the use of gene chips and sequencing, are rapidly eclipsing traditional methods of detecting human genetic variation and mutations.

Introducción

 Actualmente es más común buscar los factores genéticos responsables de las enfermedades raras.

 En las enfermedades comunes para la evaluación de riesgo se sigue utilizando factores de riesgo clásicos obtenidos en la HC.

 Debido a la diversidad humana no se considera que existe una secuencia genómica Humana “Normal”.

 En sitios específicos del genoma existen diferencias “variantes” que se consideran como “normales” (WT) debido a su frecuencia en la población.

N Engl J Med 2010;362:2001-11.

 Our initial concerns were cost and data accuracy, but the major challenges turned out to be the logistics of delivering genome sequence information to clinicians, how clinicians use the data, and how patients and their families deal with the secondary (incidental) fndings.