Transcript Diapositiva 1

Métodos hidrodinámicos
Técnicas que involucran el transporte, movimiento, de
macromoléculas biológicas en un fluído (agua)
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Sedimentación (velocidad y equilibrio)
Electroforesis (nativa y desnaturalizante)
Gel filtración, SEC
Dispersión de luz, light scattering (clásica y dinámica)
Obtenemos información de estructura cuaternaria, peso
molecular, composición de subunidades, agregados,
forma, grado de solvatación
SEDIMENTACIÓN
Transporte de una partícula en solución sometida a una fuerza
(gravitacional o centrífuga)
Para sedimentar una partícula sólo por acción de la gravedad,
deben ser partículas grandes.
Para separar macromoléculas biológicas en suspensión por
sedimentación debemos usar fuerza centrífuga
(CENTRIFUGACIÓN)
Y aceleraciones altas!
Particula en suspensión en medio fluído, en tubo de centrífuga,
contenido en un rotor, que gira alrededor de su eje A a una
velocidad angular ω, rad/s (=2π/60 rpm)
Simplificando, podemos decir que la partícula está
sometida a 3 fuerzas:
Fc =fuerza centrífuga
Fb = fuerza de empuje
Ff = fuerza de friccción
Fc = m ω2 r
m = masa partícula
ω = vel. angular rotor
r = radio rotor
Fb = mo ω2 r
mo = masa del solvente desplazado
mo = m ν ρ
ρ = densidad del solvente
ν = volúmen específico parcial
Ff = f v
f = coeficiente de fricción
v = velocidad de la partícula
La partícula alcanza una velocidad constante (v) cuando la
fuerza neta es cero: Fc + Fb + Ff = 0
VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN (v)
v =
ω2 r m (1 - ν ρ)
f
Definimos COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN (S):
S= v
=
ω2 r
m (1 - ν ρ)
f
Multiplicando por el número de Avogadro N: m N = M (peso molecular)
S = M (1 - ν ρ)
Nf
M = peso molecular
(1- ν ρ) = factor de empuje
f = coeficiente de fricción
Relación entre coeficiente de sedimentación S y coeficiente de difusión D
S =
M (1 - ν ρ)
Nf
D = coeficiente de difusión:
D = k T/f = R T/N f
S = D M (1 - ν ρ)
RT
Relación de Svedberg
Determinación de peso molecular M, en forma absoluta (sin estándares
de peso molecular) pero hay que conocer S o D.
1 Svedberg, 1 S = 10-13 s
Experimento de velocidad de sedimentación. Solución de una proteína
a determinada concentración, c, la sometemos a centrifugación. Se
empieza a mover hacia el fondo del tubo y se genera una zona clara, sólo
solvente cerca del menisco y un frente móvil que limita solvente de
solución
Si seguimos la velocidad con que se mueve ese frente móvil
(en una ultracentrífuga analítica), podemos determinar S,
coeficiente de sedimentación para esa proteína
Determinación de S
v = dr/dt = ω2 r S
Integrando: ln r/ro = ω2 S (t – to)
El frente de sedimentación es bien definido al principio pero se va
deformando a medida avanza, por la difusión de las partículas en el
frente. Partículas de alto M, difunden poco y el frente es más definido.
Factores que afectan S
• Temperatura (S20,w)
• Masa
a mayor M ═> mayor S,
para ADN: M½
para proteínas: M2/3
• Forma
S es inversamente proporcional a f
Para partícula esférica no hidratada: fo = 6 π η ro
• Grado de solvatación
• Concentración
Con la concentración f aumenta ═> S disminuye con la conc.
S = So (dil)/ 1 + k conc.
• Carga
Se agrega a altas conc.
Proteína compacta
Molécula extendida
S varía con el coeficiente de fricción, que a su vez depende de la
concentración de la macromolécula utilizada, más fuertemente para
moléculas extendidas
Relación entre coeficiente de sedimentación S y tamaño, forma, hidratación
S =
M (1 - ν ρ)
Nf
f = coeficiente de fricción, depende de tamaño, forma, hidratación de la macromolécula
Relación entre coeficiente de sedimentación S y tamaño, forma, hidratación
S =
M (1 - ν ρ)
Nf
f = coeficiente de fricción, depende de tamaño, forma, hidratación de la macromolécula
Para macromolécula esférica y no hidratada: f = 6 π η ro
η = viscosidad del medio
ro = radio de la partícula, que está relacionado con su pero molecular, M:
Vo = 4/3 π ro3 = M ν /N
ν = volumen específico parcial ≈ 1/ρ (partícula) ≈ Vo / m ≈ Vo N/ M
S =
M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012
ν1/3
S =
M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012
ν1/3
A partir de la determinación de S, puedo inferir algo sobre la forma o el
grado de hidratación de mi macromolécula en estudio
So =
M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012
ν1/3
Primero, si conozco el M y asumo forma esférica, puedo calcular So
Por otro lado determino experimentalmente S, S20,w
Si
S20,w > So
═> oligómero
Si
S20, w < So
═> monómero con forma extendida
A partir de la determinación de S, puedo inferir algo sobre la forma o el
grado de hidratación de mi macromolécula en estudio
So =
M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012
ν1/3
Ejemplo: Proteína de 50 kDa, ν = 0.73 mg/ml
═> So = 4.93
Por otro lado determino experimentalmente S,
S = 5.67 S (PBS, 30ºC)
═> S20,w = 5.87 S
S20,w = 5.87 > So = 4.93
oligómero?
Calculo So para el dímero So = 7.75
Para el dímero: S20,w = 5.87 < So = 7.75
El resultado sugiere se trata de un dímero con forma extendida, f/fo >1
S
Valores de S de varias biomoléculas, organelos subcelulares y organismos
CENTRIFUGACIÓN
Diferencial (sobrenadante + sedimento “pellet”)
• La idea es sedimentar al fondo del tubo, el componente de mayor S
• Se usa para separar una mezcla compleja en los distintos
componentes en base a sus diferencias de tamaño y/o masa
• Diferencias grandes de S para lograr separación
• En general se realiza en sistema homogéneo, pero se puede hacer
a través de gradiente de densidad
Frente móvil (frente de sedimentación)
• Las partículas se mueven a una velocidad determinada por su S,
pero se detiene la centrifugación antes de que el componente más
pesado alcance el fondo del tubo
• Para separar partículas que difieren en tamaño pero no en densidad
(ej. proteínas)
• Puede ser en sistema homogéneo o en gradiente de densidad
ULTRACENTRIFUGACIÓN EN SOLVENTE HOMOGÉNEO
(SIN GRADIENTE)
1) VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN (FRENTE DE SEDIMENTACIÓN)
• Las partículas se mueven a una velocidad determinada por su S, se
separan por diferencia en su tamaño
• Se forma un frente de sedimentación
• Se usan velocidades altas (> 100.000 g)
• Se registra variación de concentración a lo largo del tubo (dC vs dr)
2) EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN
• Las partículas se separan por diferencia en su densidad
• Se deja alcanzar el equilibrio entre sedimentación y difusión
• Se forma un gradiente de concentración a lo largo del
• Se usan velocidades bajas (100 – 10.000 g)
• Se registra variación de concentración a lo largo del tubo (dC vs dr)
y se linealiza: lnC vs r2
EQUILIBRIO DE
SEDIMENTACIÓN
EQUILIBRIO DE
SEDIMENTACIÓN
Desventajas de los experimentos velocidad de sedimentación:
• Instrumento caro y especializado: ultracentrífuga analítica
• Registro de la concentración, necesita compuesto que absorba
y concentrado
• Dificultad en resolver mezclas
• Analítica, no preparativa
ULTRACENTRIFUGACIÓN ZONAL (SOBRE GRADIENTE DE DENSIDAD)
• La solución de la macromolécula se coloca sobre el gradiente
• Se usa alta velocidad
• Se forman bandas (zonas) y no un frente de sedimentación
• Mejor separación (y recuperación) de los componentes
• Se puede hacer preparativa
Partícula
Densidad (ρ) Gradiente
g/ml
RNA
Proteínas
2
1.7
1.55
1.3
Organelos
1 – 1.3
DNA
Ribosomas
Lipoproteínas
1
Cs2SO4
CsCl
CsCl
Glicerol,
sacarosa, Ficoll
Sacarosa, Ficoll,
Percol
KBr
EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN
en gradiente
CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA
En ro:
ρ(gradiente) = ρ(particula) = 1/ ν