Transcript I. Support et organisation de l`IG II. Méca. de conservation de l`IG III

I. Support et organisation de l'IG
II. Méca. de conservation de l'IG
III. Mécanismes moléculaires de
l'expression de l'Information
génétique
A. Transcription de l'ADN en ARN
B. Traduction de l'ARN en protéines
C. Particularités d'expression des virus
A. Transcription de l'ADN en ARN
 flux d'information orienté noyau  cytoplasme
- Localisation synthèse protéique ds cytoplasme : Exp. Pallade
1950
Nécessité et identification d'un intermédiaire entre ADN et
protéines : l'ARNm
- Pb : intermédiaire = vecteur + message
- Rappels : tous les ARN à la fois dans noyau et cytoplasme
ARN r (80%, à 23, 16 et 5S chez Procaryotes
28, 18, 5.8 et 5 S chez Eucaryotes)
ARN t (15%, environ 60 différents)
Mais :
- Trop peu diversifiés / protéines
- Trop stables .
- Test de Monod et Jacob (1960) sur système inductible
 apparition d'un ARN instable en partie complémentaire de ADN
A. Transcription de l'ADN en ARN
1- Modalités de la transcription chez les
procaryotes
a) Des ribosomes associés précocement aux ARNm
b) Influence des propriétés de l'ARN pol sur
l'initiation de la transcription
Rôle des sous-unités :
- se fixent sur 5 tours d'hélice (15 nm)
- a2 : permet association à b/b'
- b : liaison à l'ARN;
catalyse initiation (rifampycine) +
élongation (streptolydine);
reconnaissance des terminateurs
- Demi-vie = 60 min.
- b' : liaison à l'ADN (70%) et au facteur s
- structure quaternaire : a2, b, b', s
- 480 kDa;
- s : reconnaissance promoteurs 
précision de l'initiation
Rôle du facteur s :
- Variabilité :
- s43 pour phase végétative
- devient s37 qui permet de
- coder pour s29 qui code un nouveau jeu de gènes pour la
phase de sporulation
- Reconnaissance de séquences promotrices (1 sec.)
- Ouverture du Complexe d'initiation :
rupture liaisons H sur 10 à 14 nt
- Incorporation des 6 à 9 premiers ribonucléotides
Ensuite  transcription par ARNpol sans facteur s.
c) Influence des séquences promotrices sur
l'initiation de la transcription
- Cas de l'opéron lactose :
mise en évidence de l'interaction ADN / protéines
ARN pol de -60 à +20
Interaction forte de -20 à + 20
- Boites ubiquites sur promoteur proximal :
TATAAAA en -10  zone d'ouverture
TTGACA en -35  reconnaissance par ARN pol
 Eléments inductibles sur certains promoteurs :
HSE (Heat Shock element) 14 nt
 Active gènes codant pour des protéines qui protègent la cellule
contre les réactions dues à la chaleur
(Ex . protéines chaperonnes, protéines de l'immunité lors de
fièvre...)
- Position variable par rapport à TATA
- Suffisants pour conférer à n'importe quel promoteur le caratère
de choc thermique
IRE (Interferon regulatory element)
GRE (glucocorticoïdes )
MRE (sensible à la présence de [métaux] trace)
d) Modalités de l'élongation lors de la transcription
- Nécessité d'un brin matrice
- Pas de nécessité d'amorce
- substrats : dnTP
- Taux d'erreur : 10-4 à 10-5 très élevé car pas d'activité
exonucléasique.
(idem virus à ARN comme SIDA très changeant)
- Vitesse : 40 nt/s chez E.Coli; 200 nt/s Phage d'E.Coli
- Importance de la topologie de l'ADN :
- in-vitro : l'ADN super enroulé est transcrit plus vite que
ADN déroulé
- in-vivo :
mutants de topoisomérase II (gyrase : provoque les super
enroulements )  transcription diminuée
mutants de topoisomérase I (catalyse la relaxation des
supertours)  transcription augmentée.
e) Terminaison de la transcription
- Séquence de détachement de l'ARNpol :
palindrome G/C + séquence riche en A/T
- Palindrome permet la réalisation d'une épingle à cheveux
(tige/boucle) qui détache l'enzyme
- Terminateurs dépendants d'un facteur protéique r : interagit
avec ARN pol lors d'une pause au niveau du terminateur
-  antiterminateurs dans boîtes NUT (20 nt) en amont de
terminateur : fixent prot NUS A et N modifie l'ARNpol  ne
reconnaîtra plus le terminateur quand elle passera dessus.
f) Contrôle de la transcription : cas des opérons
ARN pol
Represseur
Inducteur
2- Modalités de la transcription chez les
eucaryotes
Rappel :
Découplage transcription / traduction dû à l'enveloppe nucléaire
a) Diversité des ARN pol eucaryotes
ARNpol I
- transcripition des gènes codant pour ARNr45S dans le nucléole
(où aura également lieu la maturation des ARNr et l'association
avec sous-unités ribosomiales)
ARNpol II
- transcription des gènes de structure + gènes ARNhn des RNP
ARNpol III
- transcription des gènes ARNt et ARNr5S et autres petits ARN
b) Diversité des séquences promotrices participant à
l'initiation de la transcription
Boites ubiquites sur promoteur proximal :
TATA  précise l'initiation au nt n°1 site START et
fixe prot TBP (sous unité de TFIID)
GC (CCGCCC)  cas des gènes "de ménage"
(cas des gène sans boite GC : impliqués dans contrôle du
développement embryonnaire)
CAAT fixe CTF
Octamère (ATTTGCAT) : fixe OTF
Cas des gènes à plusieurs promoteurs :
ex. gène de l'amylase :
2 Promoteurs P1 et P2 différents (tissu spécificité; boite TATA).
P1 utilisé dans les glandes salivaires et
P2 dans le foie.
Les 2 promoteurs peuvent ici fonctionner en même temps dans
une même cellule
c) Modalités de l'élongation et de la terminaison de
la transcription
- Elongation : idem Procaryotes
- Terminaison : mal contrôlée (peu de conséquences)
d) Contrôle de l'initiation de la transcription
Beaucoup plus fine que chez les Procaryotes
 Contrôle par état de la chromatine
Mee de Gurdon par transfert de noyau de jeunes embryons de
xénope :
 substance cytoplasmique régulée capable de rendre efficaces
tous les gènes
Dans cellules différenciées, une partie de l'info est non lue (mise
sous silence, par méthylation notamment et reploiement de l'ADN
en hélice Z par exemple)
Mee du rôle rétro-inhibiteur des protéines histones dans la
transcription :
- En système acellulaire : plus il y a d'histones, moins la
transcription se fait
- in vivo : méthylations par H3 perturbent reconnaissance par ARN
pol
 Contrôle par séquences régulatrices en CIS
Mee des URS (upstream regulatory sequences) : transfert de
gène (vecteur viral non pathogène)
 Contrôle par séquences régulatrices en CIS
- Lieu de fixation de dimères protéiques (facteurs de transcription)
- Interaction avec complexe de préinitiation
- Régulation positive ou négative
Cas des Enhancers et Silencers :
- Séquences éloignées
- Action par reploiement des l'ADN
 Intervention des facteurs de transcription
- Propriétés générales des TF : domaine de liaison à l'ADN
homéodomaine, agrafe à leucine et doigt de Zn
 Modélisation de l'initiation
de la transcription
 Modélisation de l'intervention des gènes de commande
- 5% des gènes sont dits "de commande"  tissu-spécifiques
- Séquence homéoboite 180 nt codant pour homéodomaine (60
aa)  aa 47, 50, 51 et 54 entrent dans grand sillon d'ADN
- Séquence de l'ADN fixant ces aa très conservée
GAAAGCCATTAGAG
- Cas des gènes homéotiques : provoquent homéose (mais
pas toujours homéoboite)
Bonne corrélation spatiale
chromosome / individu
- Cas des gènes de développement :
Ne provoquent pas d'homéose
Possèdent homéoboite + "paired" + octapeptide
Ex. gènes Pax
Gènes
Période et lieu d'expression chez l'embryon
Expression chez l'adulte
Pax-1
j10-17: : Mésoderme somitique: sclérotome
Non
Pax-2
j10-18 : Rein en développement. Tube nerveux, rhombencéphale,
vésicule otique, vésicule optique
Non
Pax-3
j8.5-16 : Certaines régions du cerveau, partie dorsale du tube nerveux,
cellules de la crête neurale, dermomyotome
Non
Pax-4
Non déterminé
Non déterminé
Pax-5
j10-14 : Mésencéphale, tube nerveux, foie foetal
Rate, ganglions lymphatiques, sang
Pax-6
j8-18 : Cerveau antérieur et postérieur, hypophyse, épithélium olfactif,
oeil, tube nerveux (zone ventrale)
Non
Pax-7
j8-17 : Groupe de cellules dans tout le cerveau, puis limité au
mésencéphale, tube neural (zone dorsale)
Non
Pax-8
À partir de j11.5 : Expression transitoire dans tout le tube nerveux et le
myélencéphale(j11.5 à j12.5). Thyroïde et rein en développement
Thyroïde, rein
Mécanisme d'action des gènes de développemnt
Cas des gènes Pax :
Pax-6 = gène "maître"  régule ensemble de gènes
"secondaires" régulant expression d'autres gènes-cibles
 cascade de 2000 à 3000 gènes
 mise
en place d'une structure comme l'œil
III. Méca. de l'expression de l'IG
A. Transcription de l'ADN en ARN
B. Traduction des ARNm en protéines
C. Particularités d'expression des virus
Observation des ribosomes sur ARNm
- Expérience de Gros : marquage préalable des ribosomes 35S
(+ [Mg2+] élevée évite déstabilisation) + marquage court des
ARNm au 14C ou U tritiée.
- Chez Procaryotes : traduction immédiate, couplée à
transcription dans le cytoplasme
- Chez Eucaryotes : REG + poly(ribo)somes cytoplasmiques
(un ribosome tous les 80 nt soit 10 à 20 ribosomes pour une
protéine moyenne de 400 aa).
1- Modalités de la traduction chez les
procaryotes
Rappel :
synthèse en batterie + ARN polycistronique = amplification du
message
a) Prise en charge des aa par les ARNt
L'aminoacyl-ARNt-transférase (dimère ou tétramère)
- spécifique d'un aa (  20 aminoacyltransférase)
-  ARNt isoaccepteur (flottement du code)
- hydrolyse ATP en AMP  intermédiaire acide aminé-adényl
monophosphate + 2 Pi  liaison ester covalent en 3'OH de la
queue ACC de l'ARNt + détachement de AMP
b) Initiation de la traduction
Les acteurs de l'initiation :
- ARNm
- ribosome
- NformylméthionineARNt (ARNt initiateur)
- facteurs d'initiation :
IF3 (reconnaissance petite ss-u sur séquence Shine
Dalgarno; inhibition par streptomycine),
IF2 (fixation du 1er ARNt),
IF1 (fixation de grande ss-u)
Architecture des séquences de l'initiation :
Rappel : pas de coiffe sur les ARNm des Procaryotes
- 15 nt de long environ
- complémentaire de séquence Shine Dalgarno
(ARNr 16S de petite sous-unité 30S du ribosome)
- riche en purine dont séquence conservée :
AGGAGG
- en amont (coté 5') du codon START (AUG)
 assure positionnement précis à 1 nt près
Fixation du 1er amino acyl ARNt sur petite sous-unité
- Rappel : Nformyl méthionine ARNt
- Fixation sur site P ("peptidyl")
- Intervention de IF2 qui hydrolyse GTP
Fixation à la grande sous-unité
- Intervention de IF1
- Fixation du second aa-ARNt au site A
- Site catalytique ribozyme de grande sous-unité forme lien
peptidique (sans consommation d'énergie : utilise haut niveau
énergétique des aminoacyls-ARNt)
- Largage des IF consomme un GTP
c) Elongation lors de la transcription
- Sens 5'  3' de l'ARNm
- Intervention de 2 sites distincts sur la grande sous-u ribosomiale
- Site A (aminé)
- Site P (peptide)
- Site E (exit)
très mal connu
Polypeptide en cours de synthèse
Sens de déplacement du ribosome
peptidylARNt
ARNt
sortant
aa-ARNt
petite
sous
unité
hélice de
l'ARN16S
grande
sous
unité
INITIATION
ELONGATION
Charge de l'ARNt
GTP
Synthèse
du lien
peptidique
+ Translocation
Positionnement
d'un nouvel aaARNt
GTPGDP+Pi
GDP
TERMINAISON
GTPGDP
Facteurs de
terminaison
+ GTP
Polypeptide+ARNt
GTPGDP
- Site A (aminé) : Arrivée de l'aminoacyl ARNt interagissant
avec facteurs d'élongation + GTP pour l'appariement
codon/anticocon
- Site P (peptide) : synthèse de la liaison peptidique par
action d'une petidyl transférase de la grosse sous-unité (inhibée
par chloramphénicol) (sans consommation d'énergie)
- Translocation :
- Intervention d'un facteur translocase
- consomme 1 GTP
- Progression de 3 nt
- Vitesse d'élongation : 20 aa/sec (pas très rapide mais plusieurs
ribosomes en même temps)
d) Terminaison de la traduction
- Arrivée du codon STOP sur le site A
- permet mise en place d'un facteur de dissociation qui permet
l'hydrolyse de la liaison COOH- ARNt + 1 GTP
- ce qui libère le polypeptide nouvellement synthétisé.
- Coupure du Nformyl méthionine initial et séparation des 2 sous
unités ribosomiales + 1 GTP
BILAN : Coût de la polymérisation d'1 aa
- 1 ATP pour activation de aa (rupture de 2 liaisons)
- 1 GTP pour positionnement sur site A en présence de IF2
(plus 1 GTP pour premier positionnement de Nformyl méthionine
ARNt sur site P)
- 1 GTP pour Translocation
- TOTAL : 4 liaisons Phosphoester pour une liaison peptidique +
Initiation 1 GTP + Terminaison 1 GTP
2- Différences de modalités de la traduction
chez les eucaryotes
a) Initiation
- ARNt initiateur = Méthionine (et non Nformylmeth comme chez
bactéries)
- Methionine-ARNt chargée sur petite sous unité ribosomale avant
fixation de l'ARNm +eIF2
- Autres facteurs d'initiation très nombreux et différents des
procaryotes mais participent aux mêmes étapes.
Contrôle précis du taux de synthèse en relation avec cycle
cellulaire et nutriments disponibles dans le milieu ( Procaryotes)
- Fixation de l'ARNm en 5' puis recherche ("en ligne") du premier
codon start AUG (contrôlé par séquence Kozak)
(GCC) A/G CC ATG G
- libération des IF puis
- fixation de grande sous unité
b) Elongation
- Elagage rapide de méthionine par amionopeptidase spécifique
- Pas d'ARNm polycistroniques : premier codon AUG = START.
les autres codons AUG ne peuvent plus servir
- Deux destinées des Protéines :
- cytosolique : par ribosomes libres
- protéines intramembranaires ou excrétées : guidées dans
REG par séquence signal 16 nt.
3- Contrôle de la traduction
a) Contrôle par les ribosomes
Contrôle de la population des ribosomes
Ex chez E. coli :
prot L35 et L20 (fixent ARN 23S) de grande sous unité
ribosomiale codées sur un même opéron
 grand ARN pré r possède longue séquence en 5' reployé en
tiges/boucles mimant S3D de l'ARN23S
 inhibition compétitive de L20 par son propre ARNm!
a) Contrôle par les ribosomes
Inhibition de la fixation des ribosomes sur l'ARNm par
l'aminoacyl synthétase
Ex. E. coli : AminoacylARNt synthétase spécifique de Thréonine.
compétition avec domaine en 5' de l'ARNm (qui forme deux
tige/boucles qui miment chacun la boucle Tpsi de l'ARNt
Threonine)
 L'aminoacylARNt synthétase inhibe fixation du ribosome
(mee de l'importance du domaine N tal : délétion en N tal
 se fixe toujours sur ARNm mais plus de gène pour la fixation du
ribosome!)
b) Autres contrôles
Contrôle par dé/phosphorylation des TF
Adressage des protéines
- Séquence signal 16aa reconnue par SRP
- reconnait SRP Receptor du REG
- ancrage + passage par Protéines de translocation
Maturation des protéines
- Glycosylations :
Dolichol transmembranaire transfert oligosaccharides (NAcLgu /
Man/ Glu) vers séquence consensus Asn – X- Ser (ou Thr) face
luminale du REG
 10 enzymes du REG/ golgi CIS / golgi TRANS modifient
oligosaccharides
Exemple de l'insuline
Préproinsuline 100 aa avec peptide signal (intron n°1)
|
Vésicules de sécrétion des cellules B des ilôts de Langherans
(coupure du peptide signal dans golgi) (16 aa)
|
proinsuline
84 aa|
|
Coupure du peptide C
(possède également intron n°2)|
|
Insuline active, maturation du peptide C(33 aa)
Les chaînes A (21 aa) et B (30 aa) sont reliées par des ponts disulfures dans l'insuline
mature.
Le rôle métabolique du peptide C n'est pas encore clair, mais il est sécrété (vésicules
+ clathrine) en quantité équimolaire à l'insuline. Utilisé pour quantifier la production
d'insuline.