Proteine del sistema immunitario e del sistema nervoso centrale

Catene leggere (L) e pesanti (H)

C L V L hinge C H 1 V H C H 2

La struttura della molecola è garantita da:   Interazioni non covalenti tra domini Ig Ponti disolfuro tra L e H e tra le regioni C di H (cerniera)

C H 3

Struttura generale di un anticorpo

Riconoscimento dell’antigene e funzioni effettrici : funzioni spazialmente separate e indipendenti

Il dominio immunoglobulinico

≈ 110 a.a. che ripiegano in maniera indipendente  2 strati di foglietto β planare (β sandwich)  ciascuno composto da 3-5 β-strands (5-10 a.a.) antiparalleli motivo a chiave greca Stabilizzato da:  ponti disolfuro  interazioni idrofobiche tra i due foglietti β Conservazione di specifici residui (es. Cys e Trp)

La superfamiglia delle immunoglobuline

Ab  tutte le molecole che contengono il dominio Ig; mediano funzioni di riconoscimento, adesione e legame  omologia di sequenza  tutti i geni che codificano per domini Ig si sono evoluti da un gene ancestore comune  Evento precoce: duplicazione genica, con divergenza esoni V e C. Evoluzione: 1) Divergenza “V e C” e TCR (sequenza). 2- Capacità di riarrangiare il DNA (per riconoscimento Ag)  La funzione dipende dall’interazione tra domini Ig TCR MHC

C e V in catene leggere (L) e pesanti (H)

V= N-term C= C-term H: V → 1 dominio C → 3 o 4 domini L: V → 1 dominio C → 1 dominio V: la sequenza a.a. differenzia gli Ab prodotti da un clone di linfociti B

Segmenti ipervariabili o CDR

Complementarity Determining Region: ≈ 10 a.a.

CDR3 il più variabile N-term C-term

Regioni ipervariabili o CDR

Le CDR formano delle anse esposte sulla superficie, strutture chimiche uniche → SPECIFICITA’ Sequenze conservate adiacenti → ripiegamenti del dominio Ig

IgM e IgA formano polimeri

IgM e IgA possono formare multimeri  Le IgM formano pentameri nel plasma  Le IgA formano dimeri nelle secrezioni mucose (necessario per il trasporto attraverso gli epiteli) Contengono una coda C-term di 18 a.a. con un residuo Cys necessario alla polimerizzazione Un polipeptide aggiuntivo (J: joining) di 15 kDa favorisce la polimerizzazione legando la Cys

Classi o isotipi delle Ig

 2 classi (o isotipi), che si differenziano per la regione C term della catena leggera:  κ  λ  Ogni molecola anticorpale possiede o 2κ o 2λ  C κ e C λ sono omologhe tra loro e omologhe a V κ  Non sono note differenze funzionali e a V λ  60% κ e 40% λ nell’uomo

Sito di legame per l’antigene

Ag

V L + V H 2 per ogni molecola di anticorpo

V L V H Ab

Cerniera: ≈ 10/60+ a.a.

La sequenza conformazione attorno a C H 1 assume casuale; molecola fa una torsione tra C H 1 E C H 2 La flessibilità è influenzata anche dalla capacità di V H una la di ruotare

Legame all’antigene

La flessibilità degli anticorpi (grazie alla regione CERNIERA) permette il legame a porzioni di antigeni multivalenti distanti

Legame all’antigene

Legame reversibile non covalente Il contributo di ciascuna forza dipende dalla e struttura del sito di legame e da quella del determinante antigenico

AFFINITA’:

7 forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un epitopo antigenico. Si esprime come costante di dissociazione (Kd). Tra 10 e 10 -11 M.

AVIDITA’:

forza di legame complessiva tra Ag e Ab (aumento geometrico) (rilevante per IgM)

L’Ab come Ag

isotipi: Riconosciute da Ab anti-isotipo le immunoglobuline dello stesso isotipo di una specie allotipi: L’Ab riconosce in modo specifico solo alcune Ig dello stesso isotipo della stessa specie.

Le differenze sono dovuti a diversi alleli per la regione C (polimorfismi) idiotipi: L’Ab riconosce in modo specifico la regione V dell’Ig

  MHC I e II sono strutturalmente differenti ma omologhe Sono i geni più polimorfi  Sono espressi in modo codominante -Espresso su tutte le cellule nucleate (costitutivamente) -Riconosciuto da CD8+ -Espresso sulle APC (potenziato da citochine) -Riconosciuto da CD4+

Introduzione: l’MHC

Tessuto MHC classe I Tessuto linfoide MHC classe II

Linfociti T Linfociti B Macrofagi Langherans Epiteliali timo Neutrofili Epatociti Reni Cervello Eritrociti +++ +++ +++ +++ + + (uomo, T attivate) +++ ++ +++ +++

Altre cellule nucleate

+++ + + + - (ecc. microglia)

MHC di classe I

 Eterotrimero; 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente: una catena α, codificata nell’MHC e la catena β 2 -microglobulina non codificata nell’MHC + peptide ¾ extracellulare β 2 N-term: α 1 e α 2 90 a.a., tasca di legame per il peptide Il segmento α 3 si ripiega a formare un dominio Ig (sequenza conservata): sito di legame per il CD8 25 a.a. idrofobici: attraversamento del bilayer lipidico L’espressione in membrana richiede i 3 componenti→i legami si rafforzano 30 a.a. basici, interazione con i gruppi fosfolipidici: alla membrana ancoraggio β 2 -microglobulina: interagisce con α 3 , strutturalmente omologa ad un dominio Ig, non varia tra le molecole MHC I

MHC I: tasca di legame per il peptide

 α 1 e α 2 interagiscono tra loro e formano una piattaforma di 8 nastri antiparalleli di foglietto β che sostengono 2 α-eliche  I residui polimorfi di MHC I sono confinati in α 1 e α 2  La tasca ospita un peptide (anche le terminazioni) di 8-11 aminoacidi in conformazione flessibile estesa. Le estremità del cleft sono chiuse e peptidi più grandi non riescono ad entrarvi  C-term del peptide: residui idrofobici o acidi  Le interazioni non covalenti avvengono tra residui del peptide e dell’MHC (foglietto β e α-eliche), spesso sono interazioni idrofobiche nelle “nicchie” del foglietto β e i residui àncora (1 o 2 per peptide)

MHC di classe II

 Eterotrimero: 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente: una catena α (32 34 kDa) e una catena β (29-32 kDa), entrambe codificate nell’MHC (polimorfi) + peptide N-term: α 1 e β 1 contengono i residui polimorfi, tasca di legame per il peptide α 2 e β 2 formano domini Ig e non variano tra i vari alleli di classe II 25 a.a. idrofobici, regione transmembrana a.a.

basici, idrofilica e coda  β 2 : sito di legame per CD4  Le catene α di un locus (es. DR) si appaiano con catene β dello stesso locus (DR)

MHC II: tasca di legame per il peptide

 4 nastri di foglietto β +1 α-elica: α 1  4 nastri di foglietto β +1 α-elica: β 1  I residui polimorfi di MHC II sono confinati in β 1  Le estremità della tasca sono aperte: vengono ospitati peptidi di lunghezza anche > 30 a.a. (lungh. ideale 12-16 a.a.)  Diversi ponti ionici e ponti H con le α eliche  Le interazioni non covalenti avvengono tra residui del peptide e dell’MHC II; non tutti i peptidi hanno residui àncora

MHC di classe I e II: struttura

Ogni individuo eterozigote esprime su tutte le cellule mononucleate 6 MHCI diversi: catene α codificate dai 2 alleli dei geni HLA-A, HLA-B e HLA-C Il numero totale di molecole MHCII espresse è 10-20, per gli appaiamenti eterologhi (es. DRα di un cromosoma con DRβ dell’altro)

MHC di classe I e II: CDR

MHC di classe I e II: legame al peptide

MHC classe I MHC classe II  I peptidi e le molecole d’acqua associate riempiono interamente la tasca  Differenti alleli favoriscono il legame di peptidi diversi (e quindi la possibilità di presentarli ai linfociti T)  Al riconoscimento antigenico (TCR) contribuiscono: residui esposti del peptide → specificità residui dell’MHC → restrizione MHC Potenziale elettrostatico: positivo , negativo

Interazione peptide-MHC

Una proteina per evocare una risposta immunitaria deve contenere peptidi che possano legarsi alle molecole MHC  Le molecole MHC mostrano promiscuità; la specificità viene garantita dal TCR  Le molecole MHC non distinguono tra self e non self; la sorveglianza è data dai linfociti T  I peptidi hanno in comune caratteristiche strutturali (es. lunghezza)  l’interazione è saturabile a bassa affinità (Kd= k off /k on ≈10 avere un’interazione che permette l’interazione con il TCR) -6 M con k on e k off basse, per

Introduzione: TCR

  Recettore per l’antigene dei linfociti T helper (CD4+) e citotossici (CD8+) Eterodimero costituito da due catene transmembrana, α e β, legate covalentemente (S-S)  La parte esterna è simile al Fab: TCR e Ab sono strutturalmente simili MA:  Il TCR non viene prodotto in forma solubile  Il TCR è monovalente  Non svolge autonomamente funzioni effettrici  Non esiste lo scambio isotipico (C non cambia)  Non esiste la maturazione dell’affinità (non ci sono mutazioni somatiche nelle regioni V)

Organizzazione dei geni del TCR

1) Ricombinazione somatica 2) Diversità giunzionale 3) Inserzione della regione N

 Dominio Ig variabile (V)  Dominio Ig costante (C)  Regione cerniera con Cys  Regione idrofobica transmembrana con presenza di Lys (α) e Lys e Arg (β) per interazione con CD3 e ζ  Breve regione citoplasmatica (5-12 a.a.) troppo breve per trasdurre il segnale (CD3, ζ, CD28...)

Introduzione: TCR

Differenze rispetto alle Ig

  Forma simile a una Ig ma più corta e larga Maggiore flessibilità tra C e V perché porzione più estesa  Cα non è un vero dominio Ig: la metà che si rivolge al Cβ forma un foglietto β (simile a Ig), l’altra metà contiene β strands segmento di α elica  non impaccati e un Il legame tra Cα e Cβ è dovuto anche ai carboidrati su Cα (legami H con foglietto β di Cβ)  V α →V L e V β →V H  Alcune differenze di orientamento nei CDR

Riconoscimento dell’MHC-peptide

CDR1 e 2

Riconoscimento dell’MHC-peptide

CDR3 CDR4 CDR1 e 2

 Il riconoscimento è mediato dalle CDR della catena α e β, in cui si concentra la variabilità  3 CDR della catena α si giustappongono a 3 CDR della catena β (β : una quarta CDR per il riconoscimento dei superantigeni), superficie planare  CDR3 la più variabile è posizionata in corrispondenza del centro del peptide legato all’MHC  CDR1 e CDR2 contatto con l’MHC  L’affinità del TCR per MHC/peptide è bassa (Kd 10 -5 -10 -7 ; Ag/Ab Kd fino a 10 -11 M); l’emivita 1-10s. Per questo sono necessarie le molecole accessorie per avere una risposta biologica

MHC

Riconoscimento del superAg

 I superAg stimolano tutti i linfociti T che esprimono una determinata regione Vβ nel loro TCR (non sono mitogeni ma nemmeno Ag comuni)  Si legano a MHC di classe II (codificati da diversi alleli), NON nella tasca di presentazione dell’Ag  Ogni enterotossina aggrega 2 MHC → 2 TCR Vβ contiene CDR4

I corecettori: CD4 e CD8

 Glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig  Funzione simile ma struttura diversa  Motivo per cui i T CD4+ riconoscono MHCII e CD8+ MHCI

D1 →Ig D2

 CD4: 4 domini Ig extracellulari, una regione transmembrana idrofobica, e 38 a.a. (molti basici) citoplasmatici  Mediante D1 e D2 (N term) si lega al dominio non polimorfo β2 dell’MHC II, D1-D2 fortemente impaccati e separati da D3 D4 da una regione cerniera  La regione intracellulare interagisce fortemente con una tirosina chinasi Lck, per la trasduzione del segnale

I corecettori: CD4 e CD8

 Glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig  Funzione simile ma struttura diversa  CD8: eterodimero, 2 catene omologhe CD8α e CD8β legate da S-S  Un dominio Ig extracellulare, polipeptide esteso, una regione transmembrana idrofobica, e 25 a.a. (molti basici) citoplasmatici  La regione extracellulare è altamente glicosilata per proteggere il CD8 dall’attacco delle proteasi e per mantenerlo esteso   Il dominio Ig interagisce con il dominio non polimorfo α3 di MHC I La regione intracellulare interagisce fortemente con una tirosina chinasi Lck, per la trasduzione del segnale

I corecettori: CD4 e CD8

Citochine: Caratteristiche generali

 Piccole proteine (15-30 kDa) non anticorpali, mediatori della risposta immune e dell’infiammazione  Riconosciute da recettori (Kd 10 -10 -10 -12 M)  Secrete da diversi tipi di cellule dell’immunità innata e acquisita

Citochine: Caratteristiche generali

 Pleiotropismo: prodotte da diverse cellule e attive su diversi tipi cellulari  Ridondanza: azioni simili - possono condividere R o parti di R - difetti in un componente unico: piccolo effetto - difetto in componenti condivisi: grande effetto (es. IL-2Rγ SCID severe combined immunodeficiency)  Influenzano sintesi e azione di altre citochine - antagonismo/sinergia/effetti additivi

Citochine: Caratteristiche generali

 La loro secrezione è un evento di breve durata e auto-limitato - non immagazzinate - espressione in seguito a stimolazione (mRNA con breve emivita)  La loro azione può essere locale (autocrina o paracrina) o sistemica  L’espressione dei recettori per citochine è regolata - risposta solo dei linfociti Ag-specifici - la citochina stessa può aumentare o diminuire l’espressione del suo R  Agiscono modificando l’espressione genica nelle cellule bersaglio - eccezioni: chemochine e TNF

Classificazione funzionale

 Citochine dell’immunità innata Prodotte soprattutto dai fagociti mononucleati Possono essere prodotte anche nell’ambito della risposta immune specifica Alimentano reazioni infiammatorie precoci  Citochine dell’immunità specifica Prodotte soprattutto dai linfociti T Funzione regolatrice sulla crescita/differenziamento delle popolazioni linfocitarie o Reclutamento di cellule effettrici specializzate (es. neutrofili)  Citochine ad attività emopoietica Prodotte da cellule stromali del midollo osseo, leucociti ed altri tipi cellulari Funzione regolatrice sulla crescita/differenziamento dei leucociti immaturi

Recettori per le citochine

5 diverse famiglie (struttura comune):  Recettori di tipo 1 (dell’IL-2 o dell’emopoietina) -1 o + domini con coppia di Cys conservate e sequenza prossimale alla membrana WSXWS -lega molecole con ripiegamento 4-helix bundle - struttura multimerica , indotta dal legame del L (1 catena per interazione con L e 1o+ per trasduzione del segnale→spesso condivise tra + recettori) mancano di attività Tyr chinasica intrinseca 3 subset in base alla loro capacità di legare uno dei 3 elementi comuni: gp130, common beta, and common gamma

Recettori per le citochine

 Recettori di tipo 2 (degli interferoni) - residui di Cys conservati - struttura multimerica (1 catena per interazione con L e 1o+ per trasduzione del segnale) - R per IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, IL10, IL22 - hanno attività protein-chinasica intrinseca

Recettori per le citochine

 Recettori per TNF  Superfamiglia delle Ig  Recettori a 7 α-elica transmembrana (recettori per le chemochine) e accoppiati a proteine G

Mediatori della immunità innata

 TNFα  IL-1  IL-10  IL-12  INTERFERONI di tipo 1 (IFNα, IFNβ)  IFNγ  CHEMOCHINE

TNF α

 Prodotto da macrofagi attivati  Mediatore dell’infiammazione acuta in risposta a microrganismi (gram-)  Media il reclutamento di neutrofili e macrofagi nel sito dell’infiammazione (↑ICAM endotelio)  Agisce sull’ipotalamo (febbre)  Promuove la produzione delle proteine della fase acuta (fegato)

R per TNF β-jellyroll TNF omotrimero TNF / TNFR (monomero)

Death domain

TNF α

 Effetti simili a TNF α  Prodotta da macrofagi attivati  Agisce soprattutto su linfociti T (al confine tra immunità innata e acquisita)

IL-1

Beta-trifoglio: struttura 12 beta-strands R: superfamiglia delle Ig

IL-1

IL-10

 Citochina inibitoria: Inibisce la produzione di IFNγ dalle Th1 e produce lo shift verso Th2 Inibisce la produzione di altre citochine dai macrofagi attivati Inibisce la produzione di MHCII e altre molecole co-stimolatorie sui macrofagi  Prodotta da macrofagi attivati e Th2  Agisce nell’immunità innata e acquisita IL-10 (Inter-subunit dimeric 4-helix bundles) IL-10Rα R di tipo II

La trasduzione avviene solo in presenza di entrambe le catene del R

IL-10

IL-12

 Prodotta da macrofagi attivati e cellule dendritiche  Stimola la produzione di IFNγ  Induce il differenziamento dei Th verso Th1  Aumenta le capacità citotossiche dei CTL e NK   IL-12 è un eterodimero (p40 e p35 legate covalentemente) Il recettore è formato da due catene (R di tipo I)  La trasduzione del segnale usa la via JAK/STAT

IFN α e β

 IFN-α prodotta da fagociti mononucleati IFN-β da diversi tipi di cellule (fibroblasti)  Inibisce la replicazione virale nelle cellule  Aumenta l’espressione di MHCI  Attiva le cellule NK Inter-subunit dimeric 4-helix bundles R di tipo II

IFN α e β

chemochine

Struttura β a catena corta

   Piccole citochine (8-12 kDa). 2 ponti disolfuro nella molecola Prodotto da diversi leucociti e altri tipi cellulari (endotelio, fibroblasti...) Grande famiglia di molecole (più di 50)  Funzione: permettere la migrazione leucocitaria dal circolo ai tessuti e la loro locomozione - migrazione - attivazione: doppio sito di legame delle chemochine - chemotassi  2 sottofamiglie distinte in base alla posizione delle Cys all’N-terminale: -α chemochine: struttura CXC (neutrofili) -β chemochine: struttura CC (monociti, eosinofili, linfociti)  Ogni singola chemochina lega più recettori e viceversa

7 eliche transmembrana

Mediatori della immunità acquisita

 IL-2  IL-4  IL-5  TGF-β  IL-10  IFN-γ

4-helix bundle

IL-2

  Prodotta da T (soprattutto Th) Principale fattore di crescita per le cellule T che hanno incontrato l’antigene. Azione autocrina   Attiva NK e monociti R di tipo I: 3 catene e catena alfa espressa solo da linfociti T attivati (> affinità)  Induce apoptosi nei linfociti T (risposta che si prolunga e [IL-2 ] crescenti) Fattore gamma comune

4-helix bundle   Prodotta da Th2 e macrofagi Stimola la produzione di Th2 da cellule Th vergini (fattore di crescita autocrino)     Determina lo switch isotipico verso IgE R di tipo I: 2 catene. Fattore gamma comune con IL-2 Attiva la via di JAK/STAT (STAT6) E la via IRS-2

IL-4

TGF β

     Prodotta da linfociti T, macrofagi e molti altri tipi cellulari Inibisce la proliferazione dei T Inibisce l’attivazione dei macrofagi Agisce sui leucociti polimorfonucleati e le cellule endoteliali, antagonizzando l’effetto delle citochine pro-infiammatorie Recettori di tipo I e II: trasducono il segnale tramite un dominio Ser/Thr chinasico Anello formato da 2 ponti disolfuro in cui si infila un terzo: nodo

IFN γ

     Principale citochina attivatoria dei macrofagi Importante sia per immunità innata sia specifica Citochina prototipica di Th1 Prodotto da NK, Th1 e CTL   Attraverso la via di STAT1 stimola la produzione di MHCI enzimi che sintetizzano NO, IL-12 (sinergia) Importante per uccidere i microbi fagocitati Shift verso IgG Omodimero: intersubunit 4 helix bundle R di tipo II

Mediatori dell’emopoiesi

 GM-CSF (granulociti-macrofagi)  M-CSF (monociti e macrofagi)  G-CSF (granulociti) CSF= colony-Stimulating Factor Differenziazione e espansione delle cellule progenitrici midollari  4-helix bundle a catena breve o lunga  R famiglia delle Ig (M-CSF) o di tipo I (GM-CSF e G-CSF)

Regolatori della risposta immune

 Le citochine sono regolatori positivi e negativi  La loro azione dipende dall’ambiente (altre citochine, recettori espressi e loro subunità)  Agiscono in diversi momenti della risposta immune  Regolano il tipo e l’ ampiezza della risposta immune

Patologie da aggregazione proteica • • • • A b a -Sinucleina Huntingtina Proteina Prionica 

Malattia di Alzheimer



Malattia di Parkinson



Corea di Huntington



Malattia di Creutzfeld-Jacob

Fibrille di

a

-sinucleina (M. di Parkinson)

Conway et al., Science 2001

Proteina Prionica

Designed protein tetramer zipped together with a hydrophobic Alzheimer homology: A structural clue to amyloid assembly