Transcript Anticuerpos Anti-HLA en el trasplante renal

Anticuerpos Anti-HLA en el
trasplante renal:
detección y significado
Massari, Pablo
Castellano, Mauro
Carrera de Posgrado en Nefrología UCC
Servicio de Nefrología y Programa de Trasplantes Renales
Hospital Privado-Centro Médico de Córdoba
12 de Mayo de 2011
Definición
Clases HLA
Respuesta inmunologica
INTRODUCCION
• Complejo Mayor de histocompatibilidad
(MHC):
– Región heterogénea y polimorfa del brazo corto
del cromosoma 6 (6p21.3).
– Codifica moléculas de superficie celular (HLA).
– Herencia mendeliana codominante.
– Dividido en 3 regiones:
• Clase I
– HLA A, B y C.
– Expresadas en casi todas las células nucleadas del
organismo (Ausente en eritrocitos y trofoblastos).
– Formados por una cadena pesada (α) codificada en el
HLA y una cadena liviana (β) codificada en el Cr 15.
– También contiene HLA-E, HLA-F y HLA-G (Moléculas
MHC no Clásicas).
– Unen péptidos derivados del citoplasma.
– Presentan antígenos peptídicos a linfocitos T CD8+
induciendo apoptosis o liberación de citotoxinas.
• Clase I
– (Moléculas MHC no Clásicas)
•
•
•
•
•
Limitado Polimorfismo.
Baja expresión en la superficie celular.
Distribución celular y tisular muy selectiva.
Son reconocidas por receptores NK (RNK).
HLA G :
– expresado en trofoblasto fetal y células epitelio tímico.
– Se une a ILT-2, ILT4, KIR2DL ► ( - ) lisis por NK y LT.
– Inducción de tolerancia materno-fetal.
– Vigilancia del sistema inmune frente a tumores.
• HLA E :
– Se une a CD94/NKG2A que ( - ) actividad NK y de ciertos LT.
• HLA F :
– Se expresa en amígdalas, bazo y timo.
– Se unen a LIR 1 y LIR 2 e inhiben linfocitos
• Clase II:
– HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP.
– Expresados constitutivamente en células B, células
dendríticas y monocitos. Pueden ser expresados en
otras células durante la inflamación (citoquinas: IL-2 y
IFN-gamma).
– Constituidas por una cadena pesada (α) y una cadena
liviana (β) ambas codificadas en el MHC.
– Unen péptidos derivados de proteínas extracelulares.
– Presentan antígenos a Linfocitos T CD4+.
• Clase III
– No contiene ningun gen del HLA, pero codifica
genes de importancia en la respuesta inmune:
• Complemento (C2, C4 y factor B).
• Factor de Necrosis tumoral.
• Heat shock protein.
TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE
ANTICUERPOS ANTI-HLA
Crossmatch (XM)
• Busca anticuerpos anti-HLA en el suero del
receptor que reaccionen con los Antígenos HLA
del donante.
• Suero del receptor + Células del donante
– XM + : Presencia de anticuerpos en el suero del
receptor dirigidos contra las células del donante →
contraindica el trasplante.
– XM - : Ausencia de anticuerpos en el suero del
receptor dirigidos contra las células del donante →
permite el trasplante.
Crossmatch (XM)
• Objetivos:
– Detectar Anticuerpos
– Identificar Especificidad
• Métodos:
– CDC (Citotoxicidad Dependiente Complemento)
– ELISA
– Citometría de Flujo
– Luminex
Crossmatch (XM)
• Variantes:
– Contra panel PRA (Panel Reactive Antibodies) pre
y post trasplante.
• CDC, ELISA, CF, LUMINEX
– Contra donante vivo (DV) pre y post trasplante.
• CDC-AHG en LT y LB, CF, LUMINEX
– Contra donante cadavérico (DC)
• CDC-AHG en LT y LB, CF
Crossmatch contra Panel (PRA)
• Porcentaje de reactividad del suero del paciente
frente a un panel de células (antígenos)
• Medida del grado de sensibilización
– Pacientes bajo riesgo : PRA < 20%
– Pacientes elevado riesgo : PRA > 30%
– Pacientes hipersensibizados : PRA > 70%
• Fuerza
• Especificidad
Crossmatch contra Panel
• PRA por CDC.
• PRA por CF (screening clase I/II).
• PRA por Luminex (screening clase I/II).
Sensibilidad en detección de
Anticuerpos anti-HLA
• Mayor Sensibilidad
• FlowPRA
• ELISA
• CDC
• Menor Sensibilidad
Citotoxicidad dependiente de Complemento
ELISA
Citometría de flujo
Luminex
METODOS
Citotoxicidad dependiente de C’ (CDC)
• Reacción antígeno-anticuerpo con fijación de complemento
y visualización de la reacción con un colorante.
• Se pueden utilizar células (linfocitos T y/o B) aislados de
sangre periférica, ganglio linfático o bazo
• La reacción se cuantifica según el porcentaje de células
muertas.
• Este es el método de referencia clásico.
• Prueba cruzada pretrasplante positiva frente a células T
contraindica el trasplante (Patel y Terasaki 1969).
• La significación de un resultado positivo con células B
mediante la misma técnica no contraindica el trasplante en
todos los casos. (Stites y cols., 1997).
Citotoxicidad dependiente de C’ (CDC)
• Diacetato de Fluoresceína: colorante vital capaz de atravesar la membrana intacta
• de las células.
• Bromuro de etidio: se incorpora al ADN; las membranas intactas lo excluyen.
Citotoxicidad dependiente de C’ (CDC)
• Reacción CDC
Citotoxicidad dependiente de C’ (CDC)
• Score de las reacciones de CDC
% cel muertas
0 – 10
11 – 20
21 -50
51 – 80
80 – 100
Unreadable
Valor asignado
1
2
4
6
8
0
Interpretación
Negativo
Borderline negativo
Positivo débil
Positivo
Positivo fuerte
Sin cel, contaminación
Citotoxicidad dependiente de C’ (CDC)
Agregado de Inmunoglobulina Humana →Mayor sensibilidad
Incrementa
probabilidad
de unión de C’
*Cantidad de anticuerpos anti-HLA menor al umbral de detección por método estándar.
*Anticuerpos no fijadores de C’.
Citotoxicidad dependiente de C’ (CDC)
• Limitaciones:
– Determinamos presencia de anticuerpos citotóxicos (fijadores de
complemento: IgM e IgG)
– No permite distinguir entre la presencia de anticuerpos relevantes en
el trasplante (anti-HLA) y anticuerpos no relevantes en el trasplante
(por ejemplo, autoanticuerpos, generalmente IgM).
– Variante de la técnica clásica:
• Tratar los sueros con dithiotreitol (DTT) para eliminar la IgM.
• Mediante este tratamiento sólo detectaríamos anticuerpos IgG presentes en el
suero.
• Algunos anticuerpos de isotipo IgM pueden presentar especificidad anti-HLA y
se han asociado en casos aislados con rechazos hiperagudos y con una menor
supervivencia del injerto (Katznelson y cols., 2002; Smit y cols., 1991; Taylor y
cols., 1989; Chapman y cols., 1986).
– Para la determinación del grado de PRA se necesita ensayar cada
suero con un panel amplio de células (alrededor de 40), por lo que
este tipo de determinaciones tiene una demora considerable.
Alo/Autoanticuerpos?
• Aloanticuerpos: IgG
• Autoanticuerpos: IgM
DTT: Rompe enlaces disulfuro que
unen al pentámero de IgM.
Suero + DTT
POSITIVO
NEGATIVO
IgG
IgM
Autoanticuerpos
• Pac.con LES
• Pac.tratados con antiarrítmicos candidatos a tx cardíaco
• Pac.tratados con medicación antihipertensiva
• PRA mayor 80% no específico y reacción fuerte
• Crossmatch positivo entre hnos idénticos
• Crossmatch positivo ,c/DTT negativo
• Mayor reactividad al frío
• Mayor reactividad a los LB
Citotoxicidad dependiente de C’ (CDC)
• Ventajas
– No se necesita utilizar equipos de difícil manejo y
calibración para la interpretación de los
resultados.
– En la prueba cruzada pre-trasplante es la técnica
de referencia.
ELISA
• Detección de anticuerpos presentes en un suero que son capaces
de reconocer antígenos purificados adheridos a un soporte sólido.
• Revelado → uso de un segundo anticuerpo marcado con un
enzima y adición de un sustrato de la enzima que origina una
reacción colorimétrica interpretada por espectrofotometría.
ELISA
ELISA
• Ventajas:
–
–
–
–
–
–
–
–
Determinación rápida y específica
Cubren todas las especificidades
No se requieren cel. viables
Detecta sólo IgG (se usa para screening de ac antiHLA: IgG)
Detecta Ac contra Ag de clase I y II
Detecta Ac HLA específicos y Ac HLA que no unen
complemento (IgG2,IgG4)
> sensibilidad, detecta Ac de bajo título
Se puede realizar el XM después del trat. con antiCD3, anti-timogl, anti-CD20
ELISA
• Limitaciones de la técnica
– Sólo podría utilizarse para el estudio de anticuerpos
anti-HLA presentes en el suero de pacientes en lista de
espera, pero no en la prueba cruzada pretrasplante.
– La fuente de la que se obtengan los antígenos
purificados es fundamental para la interpretaciónde
resultados.
– Algunas casas comerciales utilizan plaquetas para
obtener los antígenos por lo que estas preparaciones
a pesar de contener teóricamente sólo moléculas HLA
suelen estar contaminadas con antígenos plaquetarios
que pueden dar lugar a falsos positivos
Citometría de Flujo
• Reacción antígeno-anticuerpo sobre la superficie celular
visualizada mediante la utilización de un segundo anticuerpo
marcado con un fluorocromo y el uso de un citómetro de flujo.
• Técnica de análisis celular; medición de características de dispersión
de luz y fluorescencia de las células. Suspensión celular.
• Las muestras son las mismas que para CDC, pero no es necesario
separar las poblaciones T y B, ya que el uso de anticuerpos
monoclonales marcados con fluorocromos nos permite distinguirlas
en el citómetro.
• Las células deben tener también buena viabilidad
• Es hasta cien veces más sensibles que el método de CDC en la
detección de anticuerpos en linfocitos y además no requiere
fijación del complemento (Stites y cols., 1997).
Citometría de Flujo
Antígeno
Superficie celular
Citometría de Flujo
• Citómetro de Flujo:
– Instrumento que detecta
cada célula presente en
una corriente de líquido
iluminada por un haz de
láser (Janeway y
cols.,2003).
Citometría de Flujo
Fundamento:
• Estructura Básica:
• Sistema Fluídrico
(inyección de la
muestra)
• Sistema Óptico
(Fuentes de luz)
• Sistema Eléctrico
(amplificador-convertidor)
Citometría de Flujo
• Parámetros celulares medidos:
– El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o FSC)
– La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC)
– Intensidades relativas de emisión de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3, FL4,
etc.)
Complejidad
interna
Citometría de Flujo
• Limitaciones de la técnica
– Se requiere de un aparataje sofisticado y calibración óptima del
citómetro.
– Determinamos es la presencia de anticuerpos pero no permite
distinguir entre la presencia de anticuerpos relevantes y no
relevantes en el trasplante.
– Para la determinación del grado de PRA y de la especificidad de los
anticuerpos presentes en el suero de los pacientes en lista de espera
las limitaciones son las mismas que en el caso de la
microlinfocitotoxocidad.
Citometría de Flujo
• Ventajas
– Mayor sensibilidad que CDC.
– En determinados grupos de pacientes (aquellos en que existe rechazo
previo, los que presentan PRA elevado y riñón límite) una prueba
cruzada negativa con células T utilizando la microlinfocitotoxicidad y
positiva usando citometría de flujo sería predictivo de una peor
supervivencia del injerto frente a un resultado de prueba cruzada
mediante citometría de flujo también negativo (Martín y cols., 2003)
– Permite diferenciar anticuerpos IgG de IgM
Luminex
• Método similar a la citometría convencional,
utiliza microesferas recubiertas de moléculas
HLA en lugar de células.
• El uso de la citometría de flujo permite el
escrutinio de anticuerpos séricos frente a
antígenos HLA con una sensibilidad mayor que
el método convencional de
microlinfocitotoxicidad dependiente de
complemento.
LABScan 100® System
PMT
Photo Multiplier Tube/Rep
Reporter Laser
Classification Laser
Avalanche Photo
Diodes/CL
Luminex
• Limitaciones de la técnica
– No puede ser utilizado en la prueba cruzada pretrasplante.
– Se requiere de un aparataje sofisticado y calibración óptima del
citómetro.
– La fuente de la que se obtengan los antígenos purificados es
fundamental para la interpretación de resultados. Elevados
costes.
• Ventajas
– Permite determinar de manera rápida la PRA y especificidad de
los sueros de pacientes incluidos en lista de espera.
– Teóricamente se detectan sólo anticuerpos frente a moléculas
HLA.
– La sensibilidad de la técnica es comparable a la de la citometría
convencional.
SIGNIFICACIÓN CLÍNICA
•
•
Revisión que intenta validar TEORÍA
Anticuerpos puede:
HUMORAL.
–
–
–
–
–
Causar rechazo renal hiperagudo in vitro.
Conducir a depósitos de C4d asociados con falla temprana del injerto renal.
Buenos marcadores de sensibilización, conduciendo a rechazo agudo prematuros
Presentes en 96% de 826 pacientes que presentaron rechazo del injerto renal.
Asociados con rechazo crónico en 33 estudios de injertos renales, cardíacos, pulmonares y
hepáticos.
– Aparecen en circulación ANTES del rechazo renal.
•
Nuevas Hipótesis
– Si la Teoría Humoral es aceptada, pacientes que presentan anticuerpos pueden ser tratados
con inmunosupresión hasta que los anticuerpos desaparezca, para demostrara hasta donde el
rechazo crónico puede ser bloqueado.
– En pacientes que no presentan anticuerpos, la inmunosupresión puede ser reducida hasta que
aparezcan los anticuerpos.
• Estudio prospectivo. 8 años de seguimiento.
• Objetivo:
– Analizar influencia de DSA preformados identificados por
ELISA en la sobrevida del injerto.
– Evaluar incidencia de rechazo mediado por anticuerpos
(AMR) en pacientes con y sin desensibilización pre injerto.
• 237 trasplantes renales ABO compatibles (221
cadavéricos y 16 donantes vivos).
• CDCXM cel T y B negativos.
• Screening retrospectivo con ELISA para DSA.
• Episodios de rechazo confirmados por biopsia.
• 308 pacientes trasplantados renales.
• CDCXM T y B negativos.
• Se excluyeron 2 pacientes que estaban con terapia de
desensibilización.
• 69 pacientes (22%) desarrollaron FCXM preoperatorio positivo.
• Seguimiento con FCXM trimestral.
• Dos grupos:
– I: pacientes que negativizaron XM
– II: pacientes que no negativizaron XM
• Igual esquema de inmunosupresión: Metilprednisolona +
Tacrolimus + Micofenolato mofetil.
• Rechazo confirmado por biopsia según criterios Banff 97.
• Estudio prospectivo, unicéntrico.
• Diseñado ad hoc para determinar si la presencia
de anticuerpos contra panel anti-HLA clase I y/o II
son predictivos de pérdida de injerto debido a
CAN.
• 512 trasplantados, 91 (17.8%) con anticuerpos
anti-HLA +
– 55 (10.7%) anti-HLA class II
– 20 (3.9%) anti-HLA class I
– 16 (3.1%) anti-HLA class I and class II
Conclusiones
• Avances en materia de detección de anticuerpos
Anti-HLA.
• Anticuerpos Anti-HLA son predictores de Rechazo
Crónico y aparecen antes de que este se
produzca.
• Principalmente Anticuerpos Anti-HLA II están
involucrados en Falla del Injerto.
• Nuevas líneas de investigación para tratamiento
de desensibilización y evitar progresión a Fallo de
Injerto.
MUCHAS GRACIAS!