Transcript Présentation générale du projet

Intérêts de l’immunofluoresence et
des méthodes moléculaires pour le
diagnostic de pneumocystose
Méthodes par coloration
-
MGG
calcofluor
Gomori-Grocott
bleu de toluidine
En particulier avec les prélèvements
« pauvres » : expectorations ou
patients non sidéens
Immunofluorescence
Lim, Applied microbiology , 1974
- 108 ech patients immunodéprimés clinique/radio suggérant PCP
- crachats induits ou aspirations tracheales
- IFD : Ac obtenus chez le lapin
Clinique et/ou radio
Nbre patients avec IFD
+
-
total
Très en faveur de PCP
25
10
35
Suggestifs de PCP
8
25
3
Négatifs (contrôles)
3
47
50
Immunofluorescence
Lim, Applied microbiology , 1974
Histologie
Nbre patients avec IFD
(methenamine-silver sur biopsie)
+
-
total
+
9
0
9
-
2
4
6
total
11
4
15
Immunofluorescence
Lim, Applied microbiology , 1974
 bonne spécificité de la technique : pas de confusion possible
 gain de sensibilité p/t à la méthode de référence de l’époque ?
(anapath.)
Immunofluorescence
Milder, J. Clin. Microbiol. , 1980
- rats immunodéprimés par injections sc de cortisone 2/semaines.
- sacrifice de 4 rats toutes les semaines
* biopsie de poumon : Gomori-Grocott
* LBA : Giemsa et IFI (Ac obtenus chez le lapin)
Immunofluorescence
Milder, J. Clin. Microbiol. , 1980
Nombre rats positifs
4
3
2
1
IFI
Giemsa
histologie
0
1
2
3
4
Semaines
5
6
7
Immunofluorescence
Milder, J. Clin. Microbiol. , 1980
 au moins aussi sensible que l’histologie pour le diagnostic très
précoce de l’infection.
 sensibilité très supérieure au Giemsa sur LBA
 pas de problème de spécificité.
Immunofluorescence
Procop, J. Clin. Microbiol 2004
- 313 échantillons examinés (LBA ++).
Diff-Quick, Gomori-Grocott, Calcofluor, Merifluor White® (IFD)
- echantillon considéré + si positif avec 2 techniques au moins.
technique
Sensibilité
Spécificité
VPP
VPN
Diff-Quick
48.4
99.6
96.9
88.0
Calcofluor
73.8
99.6
98.0
93.4
Gomori
76.9
99.2
96.2
94.2
IFD
90.8
94.7
81.9
97.5
Immunofluorescence
Wolfson,
J. Clin Microbiol, 1990
Aslanzadeh,
Infection, 1996
Ng
J. Clin Microbiol, 1990
Ng
J. Clin Microbiol, 1990
Halford,
Cytopathology, 1994
148 ech
double aveugle
IFD : 100%
Giemsa : 65%
168 ech
IFD : 100%
CW : 57%
182 ech
(VIH ou « à risque »)
163 ech
(VIH ou « à risque »)
384 ech
IFI : 90 %
DQ : 73 %
Gomori : 72%
Bleu toluidine : 71 %
IFD : 97 %
DQ : 90 %
IFD : 86 %
Gomori-Grocott : 66 %
Immunofluorescence
25 LBA VIH+
IFI : 19 +
Gomori-Grocott : 17+
43 IS VIH+
IF > Gomori
Rigole, Pathol. Biol.
1997 (abstract)
100 LBA ID
IFD : 72 +
Gomori-Grocott : 68 +
Tuncer, Scand J Infect
Dis. 1998 (abstract)
30 IS ID
IF : 8 +
Giemsa et Gomori : 4 +
Elvin, BMJ, 1988
(abstract)
Immunofluorescence
Lautenschlager,
J Clin Microbiol, 1996
553 LBA ID
IF : 86%
Gomori-grocott : 81%
Immunofluorescence
Aslanzadeh, Infection, 1996 :
- 168 prélèvements respiratoires dont 58% VIH
- IFD : 19+ dont 12 crachats, 1 crachat induit et 6 LBA (100%)
CFW : 11+ dont 6 crachats et 5 LBA (57%)
Gain de sensibilité avec l’IF notamment pour les expectorations.
Immunofluorescence
Cruciani Eur Respir J. 2002
- méta analyse : comparaison de l’analyse d’un crachat induit
par rapport au LBA (« gold standard ») chez les VIH+.
- colorations : 43 %
IF : 67 % (p<0.001)
L’IF est nettement plus sensible pour les crachats induits
(VIH+).
Immunofluorescence
Kovacs, N. Engl. J. Med. 1988 (abstract)
- 49 crachats induits de patients présentant une PCP
(confirmée a posteriori compte tenu des colorations,
la clinique, l’évolution sous traitement)
IFI : 92 %
Bleu de toluidine : 80 %
Diff-Quick : 76 %
Immunofluorescence
Ng
J. Clin Microbiol, 1990
182 ech
(VIH ou « à risque »)
IFI : 90 %
DQ : 73 %
Gomori : 72%
Bleu toluidine : 71 %
Evaluation des FP avec l’IFI : 15 patients + uniquement avec IFI
 3 patients PCP certaine (réponse au tt anti-Pj)
 6 patients indéterminés
 6 ont autre cause et n’ont pas été traités pour Pj
Evaluation des FN avec toutes les méthodes : 77 patients –
 57 Vrais négatifs
 10 patients indéterminés
 10 Faux négatifs (réponse au tt anti-Pj)
Immunofluorescence
Ng
J. Clin Microbiol, 1990
Méthode
182 ech
(VIH ou « à risque »)
IFI : 90 %
DQ : 73 %
Gomori : 72%
Bleu toluidine : 71 %
Sensibilité Spécificité
VPP
VPN
DQ
72
100
100
69
GMS
75
100
100
72
TBO
74
100
100
71
IFI
80
90
93
74
Immunofluorescence
Ng
163 ech
J. Clin Microbiol, 1990
(VIH ou « à risque »)
Méthode
IFD : 97 %
DQ : 90 %
Sensibilité Spécificité
VPP
VPN
DQ
70-100
100-100
100-100
65-100
IFD
72-100
100-96
100-92
69-100
(Crachats induits – LBA)
Immunofluorescence
 difficulté de conclure en l’absence de « gold standard »
 IF : bonne sensibilité, a priori supérieure à celle des
techniques de coloration classique.
Permet de « rattraper » certains cas.
Intéressant en particulier pour les expectorationns
 deux techniques sont indispensables.
 FN de toutes les techniques
 FP de l’IF
 décrite comme plus rapide d’execution (p/t Gomori) et surtout
plus rapide et plus simple à lire.
 pas de problème de spécificité : Spécificité des Ac monoclonaux,
et reconnaissance « facile » des kystes ?
Immunofluorescence
PCR
Une capacité de détection supérieure …
Dilution des LBA : comparaison capacité de détection
x 100 p/t Gomori (Ribes, J Clin Microbiol, 1997 )
x 1000 p/t IFD (Leigh et all, J Clin Pathol, 1993)
PCR
Une capacité de détection supérieure …
Brancart,
J Microbiol Methods
2005 (abstract)
53 LBA
Arcenas,
Giemsa et IFD : 8+
PCR : 24+
Gain de sensibilité de 21%
Spécificité.
Diag Microbiol Infect
Dis (abstract) 2006
Ribes
Gomori : 37+
129 ech
J Clin Microbiol, 1997
PCR : 60+
Caliendo,
Crachats induits : IF : 64 %
232 ech
J Clin Microbiol, 1998
PCR : 96 %
Leibovitz,
J Clin Microbiol, 1995
284 ech
Crachats induits : Giemsa et GMS : 28 %
PCR : 85 %
PCR
Une capacité de détection supérieure …
46 ech
IF : 2+
PCR : 11+
nPCR : 21+
52 LBA
IFD : 81%
PCR : 100%
Khan,
J Infect, 2000
(abstract)
Tamburrini
J Med Microbiol,
1993 (abstract)
PCR
Une capacité de détection supérieure …
… pas toujours …
Caliendo,
J Clin Microbiol, 1998
Leibovitz,
J Clin Microbiol, 1995
232 ech LBA : IF et PCR : 100 %
284 ech
LBA : Giemsa et GMS : 82 %
PCR : 86 %
PCR
Pourquoi PCR pas toujours à 100 % ?
Un certain nombre de Faux Neg de la PCR sont post-traitement.
Leigh et all, J Clin Pathol, 1993
Mauvaise extraction de l’ADN
Toutes les methodes ne se valent pas …
(Lu, J Clin Microbiol, 1995)
sensibilité de 6 méthodes PCR : 100%, 100%, 57%, 60%, 33%, 23%
PCR
Une trop grande sensibilité ??
Olsson,
Clin Microbiol Infect,
2001
91 ech
IF : sens 60% spé 97% VPP 88% VPN 86%
PCR : sens 96% spe 59% VPP 52% VPN 100%
PCR
Il existe un portage sain …
Chez l’immunodéprimé : 18% (Maskell, Thorax, 2003)
Chez l’immunocompétent : 12 à 20%
(Maskell, Thorax, 2003 ; Medrano, Emerg Infect Dis, 2005 ;
Sing, J Clin Microbiol, 2000)
Pas toujours retrouvé : 0%
(Nevez, Clin Infect Dis, 2005 ; Weig, J Clin Microbiol, 1997)
PCR
Comment distinguer le portage de l’infection par P. jiroveci ?
Flori, J Med Microbiol, 2004
173 LBA de patients présentant des signes évoquant PCP
« Gold standard » : clinique, épreuve thérapeutique …
Giemsa
Gomori
PCR
RT PCR
sensibilité
spécificité
VPP
VPN
60
100
100
92
100
85
21
100
PCR
Comment distinguer le portage de l’infection par P. jiroveci ?
Flori, J Med Microbiol, 2004
Détermination de la concentration
en ADN dans l’échantillon :
La PCR en temps réel, en
permettant la quantification
de l’ADN de l’échantillon
pourrait permettre un
diagnostic biologique fiable .
PCR
 Les méthodes moléculaires ne sont pas à l’heure
actuelle de bonnes méthodes pour le diagnostic de la
PCP : trop de faux positifs dus à une trop grande
capacité de détection.
 autres utilisation possible : épidémio, screening des patients
pouvant bénéficier d’une prophylaxie, suivi de l’efficacité du tt …