Transcript Il progetto - Università degli studi di Trieste

TITOLO DEL PROGETTO
Terapia di precisione per le leucemie linfoblastiche acute pediatriche BCR-ABL-like: sviluppo di un
sistema in vitro per la diagnosi ed il monitoraggio clinico.
DURATA DEL PROGETTO
12 mesi
SETTORE DI INTERESSE ONCOEMATOLOGIA
BACKGROUND E RAZIONALE
La leucemia linfoblastica acuta (LLA) è la neoplasia ematologica più comune nei bambini (1), caratterizzata
da una proliferazione anomala di cellule immature linfoidi. Grazie ai trattamenti polichemioterapici adattati al
rischio attualmente usati in clinica la sopravvivenza a 5 anni è pari a ~90% (2). La LLA è una malattia
eterogenea dal punto di vista genetico: i linfoblasti dei pazienti presentano infatti diverse alterazioni
cromosomiche, sia numeriche che strutturali, alcune delle quali con valore prognostico e terapeutico, tanto
che la loro identificazione alla diagnosi contribuisce a definire la classe di rischio del paziente ed il relativo
trattamento da seguire. Di particolare importanza è la traslocazione t(9;22) che porta alla formazione del
gene di fusione BCR-ABL1 codificante una tirosin-chinasi (TK) chimerica costitutivamente attiva: la t(9;22) è
presente in ~3% dei pazienti pediatrici con LLA di tipo B ed è associata ad un outcome sfavorevole. Questo
tipo di LLA è potenzialmente trattabile con inibitori specifici per le TK (TKI), quali l’imatinib.(3-4) Studi recenti
hanno dimostrato l’esistenza di un sottogruppo di leucemie BCR-ABL1 like (BAL, ~10-15% delle LLA del tipo
B (5)), i cui blasti hanno un profilo di espressione genica simile a quello BCR-ABL1 pur mancando della
traslocazione t(9;22). Il preciso meccanismo patogenetico delle BAL è ancora da definire, ma esse sono
caratterizzate principalmente dall’attivazione costitutiva delle vie di trasduzione del segnale mediate dalle
chinasi ABL o da JAK-STAT ad opera di TK diverse da BCR-ABL,(6) generate da una varietà di fusioni con i
geni ABL1, ABL2 e JAK2, oppure a causa di aberrazioni geniche nei recettori di superficie (ad esempio:
PDGFRB, CRLF2) a monte di ABL o di JAK-STAT (Figura 1). I pazienti con LLA BAL costituiscono un
gruppo ad esito sfavorevole non identificato dagli attuali criteri di rischio: infatti rispondono peggio ai
protocolli in uso, come evidenziato da una più alta malattia residua minima durante la terapia di induzione (7).
Nonostante le BAL siano potenzialmente curabili con i TKI (ad esempio: imatinib, dasatinb, nilotinib come
inibitori di ABL e ruxolitinib, tofacitinib ed erlotinib come inibitori di JAK), ad oggi mancano sistemi pratici e
veloci per identificare i pazienti candidati alla terapia con TKI e l’inibitore specifico più appropriato su base
individuale. C’è’ dunque la necessità di ricorrere alla medicina di precisione per migliorare il loro decorso
terapeutico, evitando di esporre bambini con LLA BAL alle conseguenze di terapie intensive inadeguate ed
al crescente rischio di progressione della malattia. Va ricordato infatti che la ricaduta rappresenta una
complicazione clinica importante della LLA, potenzialmente letale (sopravvivenza a 5 anni ~ 50% (8)).
Questo progetto si propone di sviluppare un sistema in vitro per quantificare l’attività di TK presenti in
pazienti con LLA BAL in risposta ai TKI con lo scopo ultimo di sviluppare biosensori di facile utilizzo per la
diagnosi ed il monitoraggio clinico. Questi biosensori dovrebbero guidare il medico nella scelta del TKI
migliore per il paziente da integrare nella terapia.
OBIETTIVI
Gli obiettivi del progetto sono:
1) Messa a punto di sistemi in vitro per valutare quantitativamente l’attività delle TK BAL espresse in linee
cellulari e per lo screening di un pannello di TKI;
2) Validazione dei sistemi in vitro con campioni di cellule leucemiche di pazienti pediatrici affetti da LLA BAL
attualmente in cura con il protocollo AIEOP-BFM LLA 2009.
Questo progetto getta le basi per lo sviluppo di biosensori specifici per le TK BAL da usare al letto del
paziente. I potenziali benefici comprendono:
- la personalizzazione della cura per i pazienti LLA BAL. In futuro le analisi citogenetiche alla diagnosi
consentiranno l’identificazione delle anomalie BAL mediante tecniche di FISH, multiplex RT-PCR o RNA
seq. Tuttavia, la disponibilità di biosensori specifici per le TK sarà uno strumento utile per perfezionare la
diagnosi della LLA BAL, identificando in modo tempestivo il migliore TKI per il trattamento farmacologico,
consentendo anche di identificare i pazienti con resistenze primarie a questi farmaci, che necessitano
quindi di altre scelte terapeutiche. In tal modo i pazienti riceveranno una terapia adeguata fin dalla diagnosi,
ottimizzata per aumentare le loro probabilità di sopravvivenza e per ridurre gli effetti collaterali dovuti
all’esposizione a farmaci citotossici ad alti dosaggi dei protocolli chemioterapici convenzionali, per loro
potenzialmente inadeguati.
- il monitoraggio del decorso clinico delle LLA BAL. I biosensori potranno essere impiegati sia sugli aspirati
midollari che sul sangue periferico dei pazienti raccolti in diversi momenti della terapia per valutare l’attività
residua delle TK e/o l’eventuale comparsa di resistenze ai TKI acquisite nel corso della terapia.
- la razionalizzazione dei costi per il sistema sanitario. La personalizzazione della terapia si traduce in una
gestione più razionale dei costi a carico del servizio sanitario nazionale. Tramite la realizzazione della
medicina di precisione ed i conseguenti esiti più favorevoli della terapia, la sanità nazionale risparmierà
nell’immediato e nel lungo termine sulle prestazioni cliniche e socio-assistenziali ricollegabili ad ogni
paziente malato. Considerando inoltre che i pazienti sono bambini, si devono tener da conto anche i costi
indiretti legati alle figure genitoriali (assenze dal lavoro, malattie da stress emotivo).
- ulteriori applicazioni dei biosensori in campo medico. I biosensori sono sistemi versatili e ottimizzabili per
qualsiasi TK. Questo progetto preliminare ha perciò una potenziale applicazione anche in malattie diverse
dalla LLA pediatrica quali la leucemia mieloide cronica e i tumori stromali gastrointestinali (GIST) e può
essere strumento utile anche per lo screening di TKI di nuova generazione da introdurre in clinica.
FATTIBILITA’ e METODOLOGIA
Il sistema in vitro si baserà sul riconoscimento e la quantificazione dei substrati fosforilati dalle TK BAL. Le
sequenze aminoacidiche dei peptidi capaci di interagire selettivamente con i domini catalitici di ABL e JAK2,
le TK più comuni coinvolte nelle BAL (Figura 1), sono già state identificate (9); tali peptidi verranno
sintetizzati mediante apposito sintetizzatore automatizzato, saranno legati ad un supporto solido e verranno
incubati con i lisati proteici contenenti le TK candidate L’incubazione potrà avvenire in presenza o meno di
TKI (imatinib, dasatinb, nilotinib come inibitori di ABL e ruxolitinib, tofacitinib ed erlotinib come inibitori di
JAK) per identificare la molecola più efficace nell’inibire l’attività chinasica in esame. I fosfopeptidi saranno
quindi riconosciuti da anticorpi specifici e quantificati tramite western blot. Nel corso del progetto verranno
ottimizzate tutte le condizioni del saggio (quantità ottimale di substrato e di lisato proteico, tempo e modalità
di incubazione, riproducibilità ed accuratezza, scelta dell’anticorpo e del sistema ideale di rilevazione, limiti
di sensibilità). Per valutare adeguatamente la sensibilità e la specificità del sistema, verranno eseguiti
inoltre anche western blot per le TK candidate sui lisati di partenza, impiegando sia un approccio classico
che un approccio a singola cellula (piattaforma commerciale Milo™, Biotechne); quest’ultimo approccio
permetterà di identificare i limiti di quantificazione delle TK anche in sottopopolazioni cellulari minori,
altrimenti non rivelabili nei western tradizionali, simulando quindi la condizione di eterogeneità delle
popolazioni leucemiche alla diagnosi.
I lisati proteici saranno ottenuti inizialmente dalle linee cellulari (durante la fase di messa a punto del
sistema, Obiettivo 1) e successivamente dai blasti dei pazienti (durante la fase di validazione, Obiettivo 2).
Obiettivo 1: Sulla base dell’incidenza e della letteratura, le fusioni del gene CRLF2 (IGH-CRLF2 e P2RY8CRLF2, che costituiscono circa il 50% delle anomalie riscontrate nei pazienti BAL e che potrebbero
rispondere ad inibitori di JAK) e le fusioni del gene PDGRFβ (ETV6- PDGRFβ e EBF1-PDGRFβ, che
costituiscono meno dell’1% delle LLA di tipo B, ma la cui sensibilità ai TKI specifici per ABL è già stata
riportata (6)) saranno scelte come TK chimeriche candidate per cui verrà sviluppato il biosensore. Le linee
cellulari saranno ottenute transfettando la linea cellulare pre-B NALM6, già verificata come negativa alle
principali traslocazioni BAL (analisi preliminari), con plasmidi per CRLF2 e per EBF1-PDGRFB; tali linee
saranno generate in collaborazione con un servizio commerciale dedicato.
Obiettivo 2: Per validare i sistemi in vitro si impiegheranno i lisati proteici ottenuti dai blasti di pazienti
pediatrici con LLA arruolati nell’attuale protocollo di cura AIEOP-BFM LLA 2009, raccolti alla diagnosi e
conservati congelati presso l’ospedale materno-infantile IRCSS Burlo Garofolo di Trieste (n=30). E’ già noto
che almeno uno di questi pazienti è portatore della traslocazione EBF1-PDGRFβ potenzialmente
responsiva all’imatinib (10-11) e che un altro è portatore di un’alterazione genica in eterozigosi nel gene
ABL con l’inserzione di 35 nucleotidi alla giunzione tra esone 8 e 9 (c.1423_1424ins35), con conseguente
frameshift e stop codon, il cui ruolo nella resistenza all’imatinib è controverso (12-13). I lisati proteici di
questi pazienti consentiranno quindi la validazione del sistema in vitro con il peptide specifico per ABL.
Per gli altri 28 pazienti verranno ricercate nel corso di questo progetto le anomalie BAL con la metodica
innovativa del Targeted Locus Amplification (TLA (14-15)). Il TLA garantisce l’amplificazione ed il
sequenziamento selettivo di regioni fisicamente vicine ad un particolare gene d’interesse. Il vantaggio di
questa tecnica è che consente di identificare fusioni del gene d’interesse con geni partner non ancora
conosciuti e quindi non caratterizzabili con le attuali analisi citogenetiche ad approccio candidato. Il TLA
consente comunque di identificare le traslocazioni già note ed anche eventuali delezioni, inserzioni e
mutazioni genetiche a singolo nucleotide nella regione di DNA analizzata. Si stima che almeno 1-2 pazienti
del Burlo dovrebbero avere una fusione del gene CRLF2, consentendo quindi di recuperare i lisati proteici
necessari alla validazione dei sistema in vitro con il peptide specifico per JAK2.
Le cellule dei pazienti verranno inoltre usate per eseguire saggi di vitalità cellulare (saggio MTT, propidio
ioduro/annexina) in presenza o meno dei TKI in modo tale da correlare i dati emergenti dal sistema in vitro
ai dati di sensibilità dei blasti ai farmaci impiegati.
Un’immagine riassuntiva della metodica del progetto è presentata in Figura 2.
VALORE SCIENTIFICO E POTENZIALI BENEFICI PER IL SETTORE SANITARIO/PAZIENTI
Il successo della terapia su pazienti affetti da LLA BAL è ancora estremamente scarso; questo significa che,
trattati con protocolli convenzionali, questi pazienti rischiano di sviluppare gravi effetti collaterali, legati alla
chemioterapia somministrata, senza benefici e con rischio di ricaduta. La possibilità di inserimento di
farmaci innovativi specifici nel protocollo terapeutico, come l’imatinib, già usato per le LLA con traslocazione
t(9;22), oppure il ruxolitinib, potrebbe migliorare grandemente la prognosi. Le fusioni genetiche alla base
delle BAL sono ancora poco conosciute e rimangono molte domande che riguardano il loro meccanismo,
ma la potenziale risposta farmacologica ad inibitori specifici rende la possibilità della loro individuazione alla
diagnosi essenziale nella prospettiva della terapia personalizzata. L’esistenza di diversi TKI, la mancanza di
un razionale chiaro per preferire una molecola rispetto alle altre, l’incapacità attuale di prevedere la risposta
individuale, rallentano le scelte terapeutiche ed espongono i pazienti ad un aumentato rischio di
progressione della malattia. L’introduzione di biosensori dedicati rappresenterebbe quindi una novità a
servizio degli oncologi per la scelta e l’ottimizzare della terapia della LLA. Tutto questo si tradurrà in esisti
terapeutici ancora più favorevoli e in una razionalizzazione dei costi per il servizio sanitario nazionale.
INNOVATIVITA’ DEL PROGETTO
Questo studio svilupperà un metodo innovativo nell’ambito della medicina di precisione delle leucemie BAL.
Al termine di un anno di finanziamento ci aspettiamo di mettere a punto il modello base utile per lo sviluppo
futuro di biosensori dedicati per specifiche TK, in particolare per le LLA BAL che coinvolgano fusioni dei
geni CRLF2 e PDGRFB. Il biosensore dovrà essere strutturato come un dispositivo semplice da usarsi in
reparto, direttamente dal medico o dagli infermieri al letto del paziente, senza l’intermediazione di laboratori
di analisi con apparecchiature specializzate. Il risultato dovrà essere rapido e di comprensione immediata.
Tale sistema sarà innovativo rispetto all’attuale pratica clinico-diagnostica consentirà una diagnosi veloce e
funzionale della presenza di TK, riducendo le tempistiche che sono richieste per le analisi citogenetiche.
Inoltre, questo strumento fornirà immediatamente l’informazione riguardante il miglior approccio terapeutico,
individuando la sensibilità a specifici TKI. Contribuirà dunque ad un uso razionale dei TKI ed al
monitoraggio della terapia, determinando potenzialmente esiti clinici più favorevoli nel sottogruppo di
pazienti BAL per cui le attuali terapie non sono soddisfacenti. Il coraggio del progetto sta nel focalizzarsi in
tematiche ancora così poco conosciute e in fase di studio. La possibilità quindi di identificarne i problemi e
trovare soluzioni, di adattare a qualcosa di nuovo protocolli già esistenti o addirittura ideare nuovi metodi
adatti alla circostanza rende il progetto innovativo e stimolante.
ADEGUATEZZA DELLA STRUTTURA DELL’ENTE ALLA REALIZZAZIONE DEL PROGETTO
Il progetto sarà eseguito presso il Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università delle Trieste, secondo lo
schema temporale presentato in figura 3. Tale Dipartimento, vista la sua natura interdisciplinare, è dotato di
tutte le competenze intellettuali necessarie per eseguire questo progetto sia nel campo della farmacologia
che della proteomica e ha già delle collaborazioni in essere di lunga data con l’oncologia pediatrica dell’
l’ospedale materno-infantile IRCSS Burlo Garofolo di Trieste. Il Dipartimento di Scienze della Vita è inoltre
dotato delle attrezzature necessarie per svolgere il progetto, in particolare cappe sterili ed incubatori per le
culture cellulari, strumentazione per le analisi genetiche e proteomiche in vitro (spettrofotometri,
spettrofluorimetro, sintetizzatore automatico per peptidi, strumentazione per il western blotting e l’analisi
proteomica).
BUDGET
Si richiede un finanziamento di 100.000 euro così suddiviso:
Fasi
Euro
10000
10000
10000
Sintesi dei peptidi substrato delle TK candidate
Studisulineecellulari
Generazione delle linee cellulari
Materiale di consumo per Sistema Milo
Screening genetico pazienti con TLA
20000
30000
Validazione sistema su lisati di cellule dei pazienti
10000
Messa punto condizioni di western blotting per rilevamento TK su linee cellulari
Studisupazienti
Costiinfrastruttura
Totale
10000
100000
REFERENZE
(1) AIRTUM Working Group; CCM; AIEOP Working Group. Epidemiol Prev 2013; 37 (1) suppl 1: 1-296
(2) Bhojwani e coll. Pediatr Clin North Am. 2015;62(1):47-60
(3) Malagola e coll., Ann Hematol. 2016;95(5):681-93.
(4) Bleckmann e coll., Br J Haematol. 2016;172(6):855-69.
(5) den Boer e coll., Lancet Oncol. 2009; 10(2): 125–134.
(6) Ofran e coll. Blood reviews 2016; epud ahead of print
(7) Roberts e coll. J Clin Oncol. 2014; 20;32(27):3012-20.
(8) Locatelli e coll, Current opinion in oncology 2013; 25 (6), 707.
(9) Wu e coll., Biopolymers. 2010;94(4):475-86.
(10) Lengline e coll., Haematologica. 2013 Nov;98(11):e146-8.
(11) Weston e coll., J Clin Oncol. 2013 Sep 1;31(25):e413-6.
(12) O'Hare T e coll., Blood. 2011 Nov 10;118(19):5250-4.
(13) Park SH e coll., Ann Lab Med. 2012 Nov;32(6):452-4.
(14) de Vree e coll. Nature Biotechnology
(15) Kuiper e coll. Blood 2015 126:696.
2014; 32,
1019–1025.
FIGURA 1
Figura 1: Principali anomalie geniche associate alle BAL (immagine adatta da Ofran e coll, 2016 (6))
FIGURA 2
Figura 2: Immagine riassuntiva del progetto presentato (TKI = inibitori delle tirosin-chinasi; TLA = targeted
locus amplification).
FIGURA 3
Fasi
Mesi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Selezione dei peptidi substrato delle TK candidate
Studisulineecellulari Generazione delle linee cellulari
Studisupazienti
Studiconclusivi
Messa punto condizioni di western blotting per rilevamento TK su linee cellulari
Approvazione comitato etico
Screening genetico pazienti con TLA
Validazione sistema su lisati di cellule dei pazienti
Analisi dei dati
Report finale e pubblicazione scientifica
Figura 3: Diagramma di Gantt (TK = tirosin-chinasi; TLA = targeted locus amplification).