Transcript Endofity bakteryjne

„Obecność endofitów w tkankach
roślin a odporność na patogeny
korzeniowe”
dr Katarzyna Kubiak, mgr inż. Miłosz Tkaczyk, dr hab. Tomasz Oszako,
Marta Siebyła
Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary 8.10.2013
Plants are full of microbes!!!!!!!
Rośliny pozbawione mikroorganizmów stanowią wyjątki – (doświadczalne), rośliny
zawierające mikroorganizmy są regułą w naturze.
Fenotyp rośliny w naturze jest produktem ewolucyjnie wykształconej regulacji
ekspresji genów roślinnych i bakteryjnych, dlatego większość roślin reprezentuje
tzw. „ rozszerzony fenotyp” (“extended phenotype” według Dawkins (1999)).
Mikroorganizmy które kształtują „rozszerzony fenotyp” roślin to mikroorganizmy:
• Patogeny
• Symbionty (mutualizm ++, komensalizm +0)
• Epifity
• Endofity (kolonizacja roślin wewnątrz komórek lub w przestworach
międzykomórkowych nie powodując szkód w organizmie roślin)
Endofit oznacza = “endo” (wewnątrz) + “phyte” (roślina)
Po raz pierwszy endofity zostały zdefiniowane jako mikroorganizmy (grzyby=Fungi)żyjące
wewnątrz organizmu rośliny (Wilson, 1995).
Neotyphodium spp. są często związane z kostrzewą
trzcinową w tkankach liści. Grzyb ten produkuje
metabolity
wtórne
toksyczne
dla
zwierząt
roślinożernych.
http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/cm/management/2004/toxicosis/
Roots of Rare Wild Rice (Oryza granulate) from a
Nature Reserve in Yunnan, China
Grzyby i bakterie są najpowszechniejszymi endofitami roślin.
http://aem.asm.org/content/76/5/1642.full
Endofity zasiedlają całą roślinę - ZDROWĄ !!!!
http://www.frontiersin.org/plant-microbe_interaction/10.3389/fpls.2011.00100/full
Endofity roślinne - Normalny Fenotyp rośliny- rośliny zdrowe (lewa rycina) Endofity grzybowe liści
(A), Endofity bakteryjne liści (B), Rhizobia (C), Grzyby mikoryzowe (mikoryza arbuskularna) (D).
Endofity silnie wpływają na witalność rośliny, rośliny pozbawione endofitów (prawa rycina) chorują
(chlorozy, niska efektywność fotosyntezy, niska odporność na stresy i szkodniki) i często w naturze nie
są w stanie przeżyć.
Pierwotnie, Endofity zostały zdefiniowane przez Wilson (1995) jako “fungi that
are present in host plant tissues, during at least part of their life cycle, without
causing visible symptoms.”
Badania na temat endofitów powstałe w ostatniej dekadzie wskazują że
definicja ta posiada wady:
1. Mikroorganizmy rezydujące w roślinie niepowodujące szkód to nie tylko
grzyby mikroskopowe ale także bakterie oraz „wirusy”
2. Efekt „infekcji” mikroorganizmów w roślinie gospodarza jest warunkowy i
może przechodzić od mutualizmu do antagonizmu (każdego rodzaju
interakcji pomiędzy mikroorganizmami a roślinami),
3. Klasyczne endofity wprawdzie nie powoduje widocznych objawów
chorobowych, to mają wpływ na fenotyp rośliny: rośliny wolne od endofitów
wyglądają i funkcjonują inaczej od tego samego gatunku rośliny z
endofitami.
Endofity bakteryjne
"bakterie endofityczne" jest to termin odnoszący się do bakterii, które kolonizują wnętrze
części roślin: wnętrze korzeni, łodygi, liści lub nasion, nie powodując żadnego szkodliwego
wpływu na roślinę-gospodarza (Hallmann et al., 1997).
http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Plant_endophyte
http://aobblog.com/2013/05/what-bacteria-are-in-your-banana/
Endofityczne bakterie w roslinie - Medicago sativa,
lucerne.
.
Endofityczne bakterie w roślinie Musa sp, banan.
Pochodzenie i rola endofitów w roślinie
Większość endofitów pochodzi z ryzosfery lub fylosfery, jednak niektóre z nich
mogą być przekazywane za pośrednictwem nasion (Ryan i in., 2007).
Fylosfera = nadziemne części roślin będąca miejscem bytowania
mikroorganizmów.
Ryzosfera = strefa korzeniowa będąca miejscem bytowania mikroorganizmów.
1. Bakterie te mogą promować kiełkowanie
i wzrost roślin, przyrost biomasy,
powierzchni liści (przem. spożywczy,
energetyczny)
2. Bakterie mogą indukować
ogólnoustrojową tolerancję roślin w
odpowiedzi na biotyczne lub abiotyczne
stresy roślin (fitoremediacja),
3. Bakterie mogą indukować odporności
przeciwko patogenom (BIOKONTROLA).
Interakcja bakteria – gospodarz „host”
1. Endofityczne bakterie żyjące w tkankach roślin mogą być obligatoryjnymi lub
fakultatywnymi m-org.
2. Niektóre bakterie endofityczne mogą kolonizować tysiące gatunków roślin,
podczas gdy niektóre są dedykowane do określonych rodzin roślinnych
(Endofity są organizmami niszowymi).
3. Każdy gatunek rośliny jest gospodarzem jednego lub więcej endofitów (Ryan i
in. 2007), zazwyczaj jeden lub dwa gatunki endofitów dominują w określonym
„hoście”, (Bernardi-Wenzel i in., 2010).
Endofity – ochrona rośliny przed infekcjami
patogenów korzeni
Ochrona pośrednia – przez stymulacje wzrostu:
1. Wiązanie N – produkcja białek (np. chlorofil)
2. Produkcja fitohormonów (auksyny, cytokininy,
gibereliny)
3. Hamowanie biosyntezy etylenu (h. starzenia),
4. Stymulacja rozwoju bakterii wiążących azot (koinokulacji
soi Bradyrhizobium japonicum i Pseudomonas
fluorescens)
5. Stymulacja ” infekcji” grzybami mikoryzowymi (
pobierania wody z solami,  akumulacji cukrów, lipidów
(inokulacja Azotobacter diazotrophicus – ziemniaki – 
grzyb Glomus clarum)
6. Wytwarzanie specyficznych związków - sideroforów
Ochrona bezpośrednia – przez działania antagonistyczne:
1. Wytwarzanie specyficznych związków
• np. sideroforów ( powinowactwo do Fe niż patogeny, przez co hamują ich rozwój);
• kwasu cyjanowodorowego w zasiedlonej tkance korzeniowej roślin, ograniczającego
rozwój patogenicznych grzybów;
• ochronne biopolimery lub glikoproteiny ( bariery ochronnej przed patogenami lignifikacja ścian komórkowych np. jako mechanizm oporności na np. Colletotrichum ściany komórkowe tkanki ogórka);
2. Podnoszenie w środowisku stężenia Fe – stężenie toksyczne dla patogenów - fluoryzujący
Pseudomonas hamuje rozwój patogenów Fusarium oxysporum (korzen) i Erwinia
carotovora (korzeń, liść);
3. Endofity silnie namnażają się w miejscu zaatakowanym przez patogeny –konkurują z
patogenem o wodę i skł. pokarmowe (Bacillus macerans – patogeny Botrytis cinerea i
Botrytis fabae)
4. Produkcja antybiotyków (Pseudomonas putida - fenazynę - chroniącą ziemniaki przed
miękką zgnilizną korzenia, wywołaną przez Erwinia carotovora)
5. Produkcja enzymów litycznych (Serratia marcescens i Paenibacillus sp. wydzielają
chitynazę wykazującą wywierać aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko Fusarium
oxysporum; Bacillus cepacia poprzez produkcję β -1 3-glukanazy niszczy Rhizoctonia
solani, Rhizobium. rolfsii i przez Pythium ultimum)
Endofity korzeniowe wiążące azot atmosferyczny
Rola ekologiczna i ekonomiczna endofitycznych bakterii wiążących azot (bakterie brodawkowe) w
komórkach korzeni roślin motylkowych (bobowatych-Fabaceae), jest dobrze poznana.
Gorczyca Sinapis alba –poplon, międzyplon Pisum sativum groch – r straczkowa
Każda roślina może współżyć tylko z
określonym gatunkiem bakterii
brodawkowych, np.:
łubin współżyje z Bradyrhizobium. sp.,
soja – Bradyrhizobium japonicum,
groch, bób i soczewica – Rhizobium.
leguminosarum bv. viceae,
fasola – R. leguminosarum bv. phaseoli,
koniczyna – R. leguminosarum bv. trifolii.
Peluszka Pisum arvens-r.pastewna,
miedzyplon
Kwiatostan Trifolium hybridum –
r. pastewna
U roślin motylkowych bakterie z rodzaju Rhizobium i Bradyrhizobium stymulują komórki
korzenia do wytwarzania brodawek korzeniowych-NODULACJA. Do brodawek bakterie
przedostają się z gleby, tam się aklimatyzują, tworzą odpowiednie enzymy i warunki dla tych
enzymów w komórkach roślinnych aby efektywnie wiązać azot N2 do N – amonowego i
eksportowany do organów nadziemnych .
Nodulacja
Rhizobium
w glebie, G-
Brodawka korzeniowa
Rhizobium bakteroid
Rola ekonomiczna- Endofity wspomagają rozwój roślin
o znaczeniu spożywczym oraz energetycznym
W innych roślinach (niż motylkowe) wykryto obecność endofitów korzeniowych wiążących
azot atmosferyczny np. trzcina cukrowa (przemysł spożywczy).
• Rośliny motylkowe : do 550 kg N/ha/rok) (Gabryś, 2002)
• Trzcina cukrowa: do 150 kg N/ha/rok (Baldani, 2000).
Wiązanie azotu za pomocą endofitów ma miejsce także w korzeniach ryżu, kukurydzy
(przem. spożywczy) ale także uprawa roślin - biopaliw – np. Miscanthus i inne trawy
(przemysł energentyczny)
Saccharum officinarum trzcina
cukrowa
Miscanthus giganteus
Metodyka
Wybór prób
Sterylizacja: alkohol 70% - 3 min.;
podchloryn sodu 2,5% - 5 min.; alkohol
70%- 30 sek. i 5x woda sterylna
Fragmentacja 5x5 mm;
wyłożenie na podłoża stałe –
Obliczenie CR
Reizolowanie kultur
bakteryjnych
Identyfikacja
gatunkowa bakterii
wykazujących
antagonizm w
stosunku do
patogenów
korzeniowych
(analiza DNA i
sekwencjonowanie)
Testy antagonizmu: F .solani i B.
amyloliquefaciens (etap kolejny)
Uzyskanie czystych
kultur – posiew
redukcyjny
Wyniki :Testy antagonizmu: endofit-patogen korzeniowy
Analiza filogenetyczna – ML (program CLC) (dane z BLAST NCBI stopień homologii w %)
Wyniki
•
Nadleśnictwo*Wariant; Średnie nieważone
Bieżący efekt: F(1, 76)=2,6909, p=,10506
Dekompozycja efektywnych hipotez
Pionowe słupki oznaczają 0,95 przedziały ufności
0,35
0,30
0,25
CR
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
kontrola
Nadleśnictwo*Wariant; Średnie nieważone
zabieg
Nadleśnictwo
Piaski
Nadleśnictwo
Krotoszyn
Wariant
Bieżący efekt: F(1, 76)=2,6909, p=,10506
Dekompozycja efektywnych hipotez
Pionowe słupki oznaczają 0,95 przedziały ufności
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
Piaski
Krotoszyn
Nadleśnictwo
Kontrola
Zabieg
Nadleśnictwo*Wariant; Średnie nieważone
Bieżący efekt: F(1, 76)=2,6909, p=,10506
Dekompozycja efektywnych hipotez
Nadleśnictwo ; Średnie nieważone
Pionowe słupki oznaczają 0,95 przedziały ufności
Bieżący efekt: F(1, 50)=1,0590, p=,30839
0,35
Dekompozycja efektywnych hipotez
Pionowe słupki oznaczają 0,95 przedziały ufności
0,30
0,30
0,28
0,26
0,25
0,24
0,22
0,20
CR
•
Analizowano liście/korzenie pobrane z Nadl. Krotoszyn,
Piaski, Karczma Borowa z powierzchni kontrolnych i
testowych
Obliczono współczynnik CR (zasiedlenia endofitami) = il.
fragm. „kiełkujących”/ogólna il. fragm.
Analiza wpływu Nadl.*wariant (ANOVA, 2 –czynnikowa;
Statistica 8.0)
CR
•
0,20
0,18
0,15
0,16
0,10
0,14
0,12
0,05
0,10
0,08
0,00
0,06
Karczma Borowa
Krotoszyn
Nadleśnictwo
Piaski
Krotoszyn
Nadleśnictwo
Wariant
kontrola
Wariant
zabieg
• Analizowano liście/korzenie pobrane z Nadl. Krotoszyn, Piaski z powierzchni kontrolnych i
testowych
• Obliczono współczynnik CR (zasiedlenia endofitami) = il. fragm. „kiełkujacych”/ogólna il.
fragm.
• Analiza korelacji CR a defoliacja, witalność, syntetyczny wskaźnik uszkodzeń drzewostanów
(SYN)
CR = 0,2906-0,0906*x; 0,95 Prz.Ufn.
CR = 0,251-0,002*x; 0,95 Prz.Ufn.
0,35
0,35
0,30
0,30
0,25
0,25
0,20
CR
CR
0,20
0,15
0,15
0,10
0,10
0,05
0,05
0,00
20
30
40
50
60
70
80
Defoliacja [%]
90
100
0,00
0,8
110
Wielo Skory
Wielo
SS - df - MS - SS - df - MS kr. - gow kr. - R
Model Model Model Reszta Reszta Reszta
R2
R2
4395, 8469,
17
848 309
1,2
1,4
1,6
F
1,8
2,0
2,2
Syn
95% p.ufności
Test SS dla pełnego modelu względem SS dla reszt (korelacja endofity)
Defoli
0,584 0,341 0,302 4395,
acja
1
539 686 962 848
[%]
1,0
2,4
2,6
2,8
95% p.ufności
Test SS dla pełnego modelu względem SS dla reszt (korelacja endofity)
Wielo Skory
Wielo
SS - df - MS - SS - df - MS kr. - gow kr. - R
Model Model Model Reszta Reszta Reszta
R2
R2
p
498,1 8,823 0,008
947 556 578
Syn
0,498 0,248 0,204 1,113
1
870 871 687 387
1,113 3,360
17
387 363
F
p
0,197 5,632 0,029
668 602 684
Literatura
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Hallmann J, Quadt- Hallmann QA, Mahaffee WF and Kloepper JW (1997). Bacterial endophytes in agricultural crops.Can J Microbiol. 43:895–914.
Jha, P.N., Gupta, G., Jha P., Mehrotra, R. (2013). Association of rhizospheric/endophytic bacteria with plants: A potential gateway to sustainable
agriculture. Greener J Agri. Sci. 3:73-84.
Backman PA and Sikora RA (2008). Endophytes: An emerging tool for biological control. Biol. Control. 46: 1–
3.
Chu H, Fujii T, Morimoto S, Lin X, Yagi K, Hu J, Zhang J (2007) Community structure of ammonia-oxidizing bacteria under long-term application of mineral
fertilizer and organic manure in a sandy loam soil. Appl Environ Microb 73:485–491
Seghers, D., E. M. Top, D. Reheul, R. Bulcke, P. Boeckx, W. Verstraete, and S. D. Siciliano. 2003. Long-term effects of mineral versus organic fertilizers on
activity and structure of the methanotrophic community in agricultural soils. Environ. Microbiol. 10:867-877.
Dawkins, R. (1999). The Extended Phenotype. Oxford: Oxford University Press.
De Deyn, G. B., Biere, A., Van Der Putten, W. H., Wagenaar, R., and Klironomos, J. N. (2009). Chemical defense, mycorrhizal colonization and growth
responses in Plantago lanceolata L. Oecologia 160, 433–442.
Baldani J.I., 2000. The sugarcane story – reasons for succes in Brazil. Proc. Int. Symp. on
Nitrogen Fixation with non-legumes, Australia, 171.
Gabryś Halina: Gospodarka azotowa W: Fizjologia roślin (red. Kopcewicz Jan, Lewak Stanisław). Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2002, s. 246259.
Backman, P.A and Sikora, R.A. (2008). Endophytes: An emerging tool for biological control. Biological Control
46: 1-3.
Wilson, D. (1995). Endophyte – the evolution of a term, and clarification of its use and definition. Oikos 73, 274–276.
Chelius, M. K., & Triplett, E. W. (2000). Immunolocalization of dinitrogenase reductase produced by Klebsiella pneumoniae in association with Zea mays L.
Applied and Environmental Microbiology, 66(2), 783-787
http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/cm/management/2004/toxicosis/
http://aem.asm.org/content/76/5/1642.full
http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Plant_endophyte