Transcript 4.2 supercoiling

Struttura
terziaria del
DNA
Struttura terziaria del DNA
• Molte molecole naturali di DNA sono
circolari, senza code 3’ o 5’ libere.
• La maggior parte del DNA circolare
naturale é superavvolto.
• Il tipo di struttura tridimensionale che
coinvolge un’organizzazione di ordine
superiore degli elementi, come il
superavvolgimento, è detta struttura
terziaria.
The shape and the dynamic of a DNA chain is
strongly affected not only by the sequence but also
by topological constrictions
In virus capsid-highly packed
10 mm long
linear DNA
is packed in
a 40-50 nm
size box
Bustamante
Lab. Berkeley
Steve
Harvey Lab.
In bacteria
(see DNA supercoiling)
Packaging DNA
Histone
octamer
Histone proteins
B DNA Helix
2 nm
Packaging DNA
Histone
octamer
Histone proteins
B DNA Helix
2 nm
Packaging DNA
11 nm Histone
octomer
Histone proteins
Nucleosome
B DNA Helix
2 nm
Modello Jmol
Nucleosome.pdb
Packaging DNA
Packaging DNA
Packaging DNA
“Beads on
a string”
11 nm
30
nm
Tight helical
fiber
Looped
200 nm Domains
Protein scaffold
Packaging DNA
Nucleosomes
11 nm
Metaphase
Chromosome
30
nm
Tight helical fiber
700 nm
200 nm Looped Domains
2 nm
B DNA Helix
Protein scaffold
Cenni sulla topologia del DNA
Il DNA può essere superavvolto: l’asse dell’elica del DNA può essere, in
natura, avvolto a sua volta in un’elica stabile. Per essere stabile, il DNA
deve formare un dominio topologico chiuso, ad esempio il DNA deve
essere covalentemente chiuso:circolare.
DNA circolare rilassato superavv. solenoidale
superavv. plectonemico
Il DNA superavvolto può essere di tipo solenoidale o plectonemico (intrecciato)
How do we describe the topology of ccDNA?
Linking Number
If the ends of the
double helix are
brought together,
the # of times W
passes around C
is a Topological
constant, which
cannot be changed
without cutting the
strands.
This number is called
LINKING NUMBER
Pulling the two strands
apart without nicking them,
the number of crossings
does not change
Il numero di Linking
1
-1
2
-2
Definizione: È il numero di volte che una catena di DNA è connessa ad un’altra in modo tale
che se voglio disconnetterle devo rompere un legame covalente.
Da una proiezione (come quelle sopra) si ottiene Lk sommando algebricamente il numero
degli incroci (con il loro segno) e dividendo per 2. La somma algebrica serve a contare in
modo appropriato gli incroci “veri” e distinguerli dalle sovrapposizioni della proiezione.
+
+
-
-
Computing the linking number
+
+
-
-
With six positive
crossings and two
negative crossings,
these curves have
linking number two.
Il numero di Linking
Lk0 = 20
Il numero di Linking di due curve nello spazio è:
• indipendente dalla proiezione scelta (è una proprietà topologica delle curve e non della
proiezione spaziale scelta);
• Invariante per deformazioni continue delle curve, a meno che una delle curve non sia tagliata:
è definito solo per DNA covalentemente chiusi. Lk è invariante se le due curve sono costrette su
un piano o superavvolte nello spazio;
•Lk è sempre intero, siccome due curve possono essere connesse l’una all’altra solo un numero
intero di volte;
• Il segno di Lk cambia se l’orientazione di una delle curve è invertita;
• l’operazione di riflessione rispetto ad un piano di simmetria genera due curve con Lk invertito
di segno.
1
-1
2
-2
Il numero di Linking del DNA rilassato
Lk0 = Tw0
Lk° è N/h, dove N è il numero delle basi e h le basi/spira,
Si comprende che il processo di introdurre superavvolgimenti in una molecola di DNA
(svolgimento o sovravvolgimento dell’elica destrogira prima della chiusura di una molecola
lineare in una circolare) riduce o aumenta il numero di giri d’elica intrappolati dalla chiusura e
risulta in un cambiamento del numero Lk delle specie circolari.
Se Lk° corrisponde (all’incirca) al topoisomero con minori costrizioni possibili rispetto allo stato
lineare, il topoisomero circolare rilassato, allora la variazione da Lk° è una misura del
superavvolgimento.
∆Lk= Lk–Lk° è la differenza di linking o deficit di linking, che può essere positivo o negativo. Nel
DNA naturale, ∆Lk<0, essendo questo sottoavvolto rispetto al DNA lineare.
Più precisamente, Lk° è N/h, dove N è il numero delle basi e h le basi/spira, e può essere un
numero non intero. E’ il caso di chiusura “rilassata” ideale, che spesso non si può ottenere
(spesso i topoisomeri più rilassati hanno ∆Lk= ±0.5 o simile.) Lk° non è un vero numero di linking
(che deve essere intero), ma uno stato di riferimento (il numero di linking più prossimo è spesso
chiamato Lkm).
L’introduzione del superavvolgimento equivale all’aggiunta di uno stress torsionale, tanto
maggiore quanto corta è la molecola: ∆ Lk è spesso normalizzata per Lk°:
= (Lk–Lk°)/Lk° detto differenza di linking specifica (densità di superavv.)
Nel DNA naturale, = –0.06, in media.
Il numero di Twist del DNA
È il numero di volte che una catena si avvolge sull’altra. questo numero
è positivo se l’elica è destrogira, negativo se è levogira.
Il Twist (Tw) non è necessariamente un numero intero, e nella maggior
parte dei casi non lo è.
In genere la lunghezza del DNA ed il suo passo in soluzione
permettono di definire Tw=lunghezza(bp)/passo(bp/spira)
Generalmente, il Tw può essere definito tramite vettori
ruotanti che puntino da una curva C1 all’altra C2. Per due
curve che si avvolgono lungo un asse rettilineo, Tw è
pari all’angolo di rotazione dei vettori diviso per 2π. Il
caso di una curva circolare planare è analogo. Più in
generale, qualora le curve non siano lineari o planari, e
sia definibile la superficie di un “nastro” che le collega,
In generale il Tw può non essere intero e cambia a
seguito di deformazioni della curva C1 o della superficie
che collega C1 a C2.
Il numero di Writhe
È il numero di volte che l’asse dell’elica si avvolge su se stesso nello spazio. Il writhe (Wr)
dipende solamente dalla traiettoria dell’asse della doppia elica nello spazio, non dal fatto che il
DNA abbia 2 eliche avvolte l’una sull’altra.
Wr non ha necessariamente un valore intero. Se la traiettoria del DNA giace su un piano, Wr è
sempre 0. Wr=0 anche se la traiettoria del DNA giace su una superficie sferica.
Come mostrato in una delle diapositive
precedenti, il DNA può avvolgersi nello spazio in
due modi, essenzialmente: se si avvolge attorno
a se stesso lo fa generalmente nel modo
plectonemico (intrecciato), se si avvolge intorno
ad un oggetto, lo fa in modo solenoidale. In
soluzione il writhe isomerizza tra le due forme.
Il legame tra Tw, Wr e Lk
La relazione fondamentale che lega i tre descrittori del superavvolgimento è:
Lk=Tw+Wr
Che lega una proprietà topologica, il linking (intero), con due proprietà geometriche, il twisting
ed il writhing (interi o frazionari). Per ogni valore di Lk, esiste una distribuzione di forme
all’equilibrio che ripartiscono il Tw ed il Wr in modo differente. Nelle forme a basso Wr (in valore
assoluto), la tensione torsionale è principalmente a carico del twist dell’elica (l’elica è sotto
tensione, con un numero diverso di basi/spira rispetto allo stesso DNA lineare in soluzione);
nelle forme ad alto Wr, la tensione torsionale è scaricata grazie al superavvolgimento dell’asse
dell’elica, mentre localmente il DNA non è alterato.
Il superavvolgimento negativo (ottenuto mediante legame in forma di superelica sinistrorsa con
le proteine) è un modo per immagazzinare tensione elastica che può essere spesa per svolgere
un certo numero di spire d’elica, processo necessario per il funzionamento degli enzimi che
interagiscono con una catena del DNA alla volta (le polimerasi, ad esempio.
Supercoiling e trascrizione
Durante la trascrizione, il complesso RNAPol-RNAnascente rappresenta un oggetto molto grande, probabilmente
anche associato ad altre parti della cellula, per cui praticamente stazionario. Il DNA deve muoversi relativamente
alla polimerasi, passandogli attraverso. Ci deve essere un moto rotatorio relativo tra DNA e RNAPol; Il moto in avanti
causerebbe un accumulo di twist di fronte alla proteina ed un deficit alle spalle. Questo dovrebbe, di conseguenza,
manifestarsi come un superavvolgimento positivo di fronte ed uno negativo alle spalle della polimerasi. Siccome la
trascrizione non rompe le catene di DNA, la tensione non può scaricarsi da sola. Se il meccanismo avviene in un
plasmide libero in soluzione, supercoiling positivo e negativo possono ricombinarsi per annullarsi (per visualizzarlo,
Liu e Wang misero in soluzione una topoisomerasi in grado di rilassare istantaneamente solo il superavvolgimento
negativo ...)
Sequenze palindromiche possono
estrudere strutture cruciformi
In modo simile si possono formare le
giunzioni di Holliday
Come posso determinare il
superavvolgimento?
L’effetto degli intercalanti:
Un intercalante contiene una struttura planare aromatica, usualmente policiclica, che si può inserire tra due
coppie di basi del DNA. Questo causa uno svolgimento locale dell’elica, che risulta in un incremento del
numero di basi per spira (helical repeat) quindi una diminuzione del twist.
Ad esempio, il Bromuro di etidio lega fortemente il DNA a
doppia catena (ed ha un grande incremento della
fluorescenza quando è legato) ed il legame di ogni
molecola di etidio causa uno svolgimento locale di 26°.
NH 2
Bromuro di etidio
Br
N
NH 2
C 2H 5
CH3
NH
Cl
N
N(C 2H 5)2
Clorochina
Dall’equazione generale ∆Lk= ∆Tw + ∆Wr, un decremento del
Tw corrisponde ad un incremento del Wr, per cui un aumento
della quantità di etidio nel DNA corrisponderà ad una
transizione verso valori sempre più positivi di Wr. Si noti che
la concentrazione di 1µg/ml utilizzata abitualmente per la gel
elettroforesi satura completamente il DNA di etidio.
L’effetto del bromuro di etidio sul DNA superavvolto
+EthBr
Wr=0
Wr<0
+EthBr
Wr=0
+EthBr
Wr>0
Wr>0
Topoisomerasi I
Wr=0
–EthBr
Wr<0
Le topoisomerasi sono enzimi che agiscono sullo stato topologico del DNA, tagliandolo e ricucendolo.
La Topoisomerasi I, ad esempio, rilassa il DNA superavvolto (riduzione del Wr).
La misura sperimentale del superavvolgimento:
Sono svariati i metodi che possono dare informazioni sul DNA superavvolto, i metodi più diretti
sono l’osservazione microscopica, con particolare riguardo ai metodi che possono dare
informazioni tridimensionali (AFM, CryoEM). Le prime osservazioni al microscopio elettronico
risalgono al lavoro di Vinograd del 1963, l’anno a cui si fa risalire la scoperta del DNA circolare
(avvenuta grazie a studi di velocità di sedimentazione di DNA di polyoma virus) e del
superavvolgimento del DNA. Dalle osservazioni microscopiche si nota molto bene il fenomeno
del “branching” per il quale la tensione elastica del superavvolgimento può dare vita a strutture
plectonemiche ramificate, nello stesso modo in cui può generare strutture plectonemiche
lineari.
Dalle osservazioni al microscopio, congiunte a quelle biochimiche si è giunti alla conclusione che
il ∆Lk si ripartisce per circa il 70% in writhing e per il restante 30% in twisting. Questa
ripartizione dipende dal rapporto tra le elasticità torsionale e flessurale del DNA: se costa molta
più energia torcere il DNA che piegarlo, allora la tensione elastica del sottoavvolgimento si
scarica soprattutto sul writhe, che consente di recuperare una torsione di equilibrio; viceversa,
se costa molta più energia piegare il DNA piuttosto che torcerlo, la tensione dell’avvolgimento si
localizzerà prevalentemente a livello di twisting, senza aumentare il writhing (che comporta una
piegatura più accentuata di sezioni del DNA).
Si può prevedere che sezioni del DNA che possono assumere forme curvate, siano più
facilmente localizzate nei “loop” delle forme intrecciate, piuttosto che nei pressi degli incroci,
dove il DNA è più dritto. Si può comunque prevedere che la barriera energetica per
l’interconversione sia piuttosto bassa, probabilmente sotto kT, per cui possa facilmente avvenire
uno slittamento del DNA che, associato al “branching” consentirà ad un tratto di DNA di essere
presente alternativamente in zone di loop o di incrocio.
Un campione di DNA superavvolto al microscopio: nella
maggioranza delle preparazioni sono compresenti molecole
superavvolte, molecole circolari “nicked” che restano
rilassate e molecole lineari (la frazione di queste ultime
forme aumenta se il campione viene “maltrattato” perché il
DNA sotto tensione di superavvolgimento è fragile e basta
anche un solo “nick” per permettergli di rilassare il
superavvolgimento).
Un esempio sperimentale: la determinazione di Wr in microscopia
Per misurare Wr i metodi di microscopia ad alta risoluzione sono tra i più utilizzati, poiché
permettono di determinare direttamente la traiettoria dell’asse della doppia elica del DNA nello
spazio (o più spesso in un piano).
Un esempio: TEM di DNA superavvolto
Una immagine AFM di DNA superavvolto
(molecola di pBR322, 4361 bp): l’AFM ottiene
direttamente informazioni tridimensionali e
può determinare direttamente e
semplicemente la traiettoria tridimensionale
dell’asse molecolare della molecola osservata,
per poterne calcolare il Wr: si determina
direttamente la chiralità del
superavvolgimento.
Studi mediante gel-elettroforesi
La mobilità elettroforetica del DNA superavvolto dipende dal grado di superavvolgimento: è facile, in
opportune condizioni, distinguere i vari topoisomeri. La mobilità elettroforetica aumenta in modo
monotono con l’aumento del valore assoluto del numero di Linking. Questo è dovuto al fatto che
topoisomeri dotati di maggiore differenza di linking, hanno maggiore writhe, per cui sono più compatti.
Questo è vero a meno che non avvengano transizioni conformazionali che alterino lo stress del
superavvolgimento.
Per i campioni di DNA superavvolto nativo di tipo circolare (plasmidi), la distribuzione di topoisomeri è
spesso molto stretta ed a valori molto alti, per cui non è facile distinguere su una normale elettroforesi i vari
topoisomeri che costituiscono la popolazione.
pBR322 nativo
Pozzetti
Circolare rilassato
Lineare
Superavvolto
Una corsa elettroforetica di DNA superavvolto con ∆Lk
variabile da 0 a 8. Ogni banda contiene DNA
assolutamente uguale (stessa sequenza, lunghezza e
peso molecolare) che differisce solo per Lk. OC
rappresenta DNA “open circular” in cui le catene
fosfoesteree sono state rotte almeno in un punto di una
catena, per cui il DNA può rilassare, mantenendo una
forma circolare. Una digestione con un enzima di
restrizione avente un sito unico su questo DNA
produrrebbe una sola banda in un gel elettroforetico
analogo (banda che generalmente migra più
velocemente di OC).
Gel elettroforesi + intercalanti
Nel 1975, Keller introdusse un metodo nuovo per caratterizzare il Lk del DNA superavvolto:
l’introduzione di una quantità variabile di bromuro di etidio nel DNA durante la corsa
elettroforetica modifica lo stress del superavvolgimento, in ragione di N/360, dove  è il
numero di molecole di intercalante che si lega per coppia di basi,  è l’angolo di svolgimento
della doppia elica indotto dall’intercalante, N è il numero di coppie di basi.
Una quantità opportuna di etidio aggiunta al DNA “nativo” (che è molto sottoavvolto e appare
come una sola banda a migrazione veloce) lo svolge parzialmente fino a portarlo in un campo in
cui i vari topoisomeri hanno mobilità visibilmente dipendente dal grado di superavvolgimento.
a b c
Lo stesso DNA nativo di SV40 fatto migrare su tre distinti
(simili) gel elettroforetici contententi 0 (a), 0.016 (b), 0.06
µg/ml (c) di etidio bromuro. In (a) si notano solo la banda
contenente tutti i topoisomeri, in (b) i topoisomeri sono stati
separati grazie all’intercalazione, in (c) una maggiore
concentrazione di etidio ha rilassato tutti i topoisomeri.
Se sono contenuti e risolti tutti i topoisomeri da Lk=0 a Lk
nativo, uno può semplicemente contare il valore di Lk.
Un modo per contare ed assegnare direttamente i topoisomeri è l’elettroforesi
bidimensionale, la cui introduzione si deve a James Wang
Un esempio reale di elettroforesi bidimensionale per un
campione contenente molti topoisomeri
La risoluzione nella prima
dimensione giunge a
saturazione per topoisomeri
oltre il 18-esimo.