College of Life Sciences Experiments of Molecular Biology 设计实验

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Transcript College of Life Sciences Experiments of Molecular Biology 设计实验

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Biology
Experiments of Molecular
分 子 生 物 学 实 验
College of Life Sciences
Biology
日
Experiments of Molecular
常
要
求

上课时间:上午8:00-下午5:00, 提前5分钟进入实验室

迟到、早退每次扣3分,无故旷课每次扣10分,累计3次没成绩

请假须医院病假条或班主任签字的假条

上课时需穿实验服,不许在实验室内吃东西

实验课期间不许打闹、闲聊等,保持课堂纪律

随时保持实验台的整洁

认真作好值日工作,离开实验室须向教师声明

必须做到课前认真预习,课间做好实验记录、课后详细总结实验结果
并按时提交实验报告
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Experiments of Molecular
 严格遵守实验室的各种规章制度
 爱护实验器材
 实验器材损坏必须按规定赔偿
 用完仪器后必须复位
 注意门窗水电的安全
 在实验过程中一定要保持实验台面、地面、实验仪器有序、整洁和卫生
 每位同学负责自己实验台面和 柜体的卫生,值日生负责公用实验台、
地面等处卫生
 同学与老师之间、同学与同学之间、实验班与实验班之间一定要互相协
作配合保持公用房间卫生
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实 验 成 绩
Experiments of Molecular
参 考 书
平时成绩
60分
基因工程原理(第二版)
实验技能
20分
吴乃虎编著
实验报告
20分
分子克隆实验指南 (第三版)
实验态度
10分
黄培堂 等译
实验室常识
10分
实验设计及实施 40分
设计报告
20分
实验实施
10分
结果及分析
10分
科学出版社
科学出版社
基因克隆和DNA分析
魏群 等译
高等教育出版社
最新分子生物学实验技术
梁国栋
主编
科学出版社
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Experiments of Molecular
实 验 内 溶
 绪论—分子生物学实验的诞生和
发展
 分子生物学实验的基本知识简介

DNA重组-酶切连接、转化、筛选
 外源基因在大肠杆菌中的诱导
表达及检测
 实验规范训练、实验准备
 免疫印迹
 大肠杆菌感受态细胞的制备及质
 哺乳动物基因组DNA的提取及其
粒DNA的转化
 PCR基因扩增及扩增产物的回收
(核酸的回收)
 琼脂糖凝胶电泳
 质粒DNA的提取及其定性定量分析
 核酸的定量
定性定量分析
 植物总RNA的提取及其定性定量
分析
 演示:Southern、DNA序列测定、
RT-PCR及mRNA差异显示
 设计实验及其实施
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实
实验周
Experiments of Molecular
验
实
安
验
排
内
容
绪论—分子生物学实验的诞生和发展
1
分子生物学实验基本知识简介
分子生物学实验室常用仪器设备及其使用
2
实验规范训练及实验准备
3
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化
4
质粒DNA的提取及其定性定量分析
5
PCR基因扩增及扩增产物的回收(DNA的回收)
DNA重组(限制性酶切和连接)
6
哺乳动物基因组DNA的分离及其定性定量分析
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7
Experiments of Molecular
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化
哺乳动物基因组DNA的分离及其定性定量分析
8
重组子的筛选(蓝白筛选、比较重组子的大小和酶切片段分析)
9
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达、设计实验讨论
10
植物总RNA的提取及其定性定量分析
11
蛋白质印迹、设计实验准备
12
设计实验
13
设计实验 、 Southern(演示)
14
设计实验 、 DNA序列测定(演示)
15
设计实验 、 RT-PCR
16
设计实验
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设计实验一:
Experiments of Molecular
原核生物的酶的克隆和原核表达
限定目标:目的基因-原核生物的酶、表达载体-pET21a 或 pETBlue-2
限制性内切酶:BamHⅠ和 HindⅢ
要求:
 找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序列利用分析件进行目的基
因内部限制性内切酶的酶切分析及5’和3’末端引物的设计提交具体的
实验方案(从提取全基因组到目的基因的重组、表达及活性分析)
 第八个实验周前必须把详细的实验设计交给指导教师
 第八个实验周指导教师组织全班同学讨论每个实验设计,确定两个最好
的实验设计在全班进行具体的实验实践
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Experiments of Molecular
设计实验二: 小麦看家基因的克隆
限定目标:小麦看家基因、表达载体-pET21a 或 pETBlue-2
限制性内切酶:BamHⅠ和 HindⅢ
材料:培养10天左右的小麦
要求:
 找到小麦的具体某一看家基因(最好是酶)的基因
 提交具体的实验方案(从材料准备到看家蛋白的克隆)
 第八个实验周前必须把详细的实验设计交给指导教师
 第八个实验周指导教师组织全班同学讨论每个实验设计,确定
一到两个最好的实验设计在全班进行具体的实验实践
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设计实验三: 大肠杆菌K12碱性磷酸酶的定点突变
限定目标:大肠杆菌K12碱性磷酸酶的功能位点的突变
表达载体-pET21a 或 pETBlue-2、
限制性内切酶:BamHⅠ和 HindⅢ
材料:大肠杆菌K12碱性磷酸酶
要求:
找到碱性磷酸酶的功能位点,用PCR的方法进行定点突变。提交具体的
实验方案,第八个实验周前必须把详细的实验设计交给指导教师。第八
个实验周指导教师组织全班同学讨论每个实验设计,确定一到两个最好
的实验设计在全班进行具体的实验实践。
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设计实验四:
Experiments of Molecular
荷瘤小鼠的mRNA差异显示
限定目标:找到正常小鼠和荷瘤小鼠中有差异的mRNA
材料:小白鼠、H22腹水瘤细胞
要求:
提交具体的实验方案(从材料准备到mRNA的差异显示);第八个实验周
前必须把详细的实验设计交给指导教师;第八个实验周指导教师组织全
班同学讨论每个实验设计,确定一到两个最好的实验设计在全班进行具
体的实验实践。
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绪论—分子生物学实验的诞生和发展
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1952
J .Watson and F. Crick
Experiments of Molecular
1953
DNA Double Helix model
分 子 生 物 学 的 重 要 里 程 碑
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Francis Harry
Compton Crick
Experiments of Molecular
James Dewey
Watson
Maurice Hugh
Frederick Wilkins
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962
"for their discoveries concerning the molecular structure of
nucleic acids and its significance for information transfer in
living material"
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Werner Arber
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Daniel Nathans
Hamilton O. Smith
1965年发现限制性核酸内切酶
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978, "for the
discovery of restriction enzymes and their application to
problems of molecular genetics“
1973年斯坦福大学 Cohn 和 加州大学 Boyer: 重组DNA技术
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Paul Berg
Experiments of Molecular
Walter Gilbert
Frederick Sanger
The Nobel Prize in Chemistry 1980
"for his fundamental
studies of the
biochemistry of nucleic
acids, with particular
regard to recombinantDNA"
"for their contributions
concerning the
determination of base
sequences in nucleic acids“
1977
DNA sequencing
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The Nobel Prize in
Chemistry 1993
Kary B. Mullis
"for his invention of
the polymerase
Michael Smith
"for his fundamental
contributions to the
establishment of
chain reaction (PCR)
oligonucleotide-based, site-
method “
directed mutagenesis and its
development for protein studies"
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1997年2月 苏格兰 Wilmut 绵羊“多利”的克隆,为发育生物学研
究开拓了更广阔的空间
2000年6月
HGP提前完成,功能基因组时代到来
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分子生物学中的两项最重要的实验技术
分子生物学的诞生和发展中的瓶颈
 基因克隆(DNA重组,基因工程)
Gene clone, DNA recombination, gene engineering
基因转移载体的发现
vector
DNA操作工具酶的发现
DNA manipulation
基因合成和基因测序
sequence
 PCR技术
polymerase chain reaction
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开设分子生物学实验课程的历史沿革和重要性
 基因工程带来的革命及在我国的反响
 生物化学的发展
 分子生物学成为现代生命科学的“共同语言”和深入研究的工具
遗传学、发育生物学
生 理
微生物学、细胞生物学
神经生物学、分子免疫学
微生物
分子药理学、分子病理学
分子分类学、分子生态学
农林、畜牧等
遗 传
分 子
生态
环境
医 学
细 胞 农 林
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分子生物学实验课程的内容及应用举例
 广义的分子生物学技术
 基因克隆、PCR及一系列技术
从活细胞中提取DNA、RNA的基本技术
基因操作技术
电泳技术
感受态细胞及转化技术
重组子的筛选和鉴定技术
DNA测序技术
印迹和杂交技术
核酸定量
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达等
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基因表达及基因工程药物、基因工程疫苗
基因鉴定的几种方法及人类疾病基因的鉴定
Southern(DNA)印迹
Northern (RNA)印迹
Western(蛋白)印迹
PCR基因扩增
逆转录PCR(RT-PCR)
人类疾病基因的鉴定
基因突变及生物大分子结构功能的研究
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二十一世纪生物学的新热点及领域
结构生物学(Structural Biology)
生物大分子的高级三维结构与功能的统一
生物大分子之间的互作 → 基因的社会学
分子发育生物学(Molecular Developing Biology)
器官发生
基因表达,基因互作
胚胎形成
个体发育
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21世纪生命科学发展的重要态势
对生命现象的认识从单基因水平向全基因组整体水平发展
现代生命科学研究的理论与技术从较长期的积累走向应用
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分子生物学实验的基本知识简介
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 基因工程又称DNA重组技术
 外源基因通过体外重组后,导入受体细胞内,使这个基因能够在受体细
胞内复制、转录、翻译、表达的操作
 包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译
表达等全过程
 有人也将其它使细胞基因组结构得到改造的体系也包括在基因工程内以
区别于DNA重组
 基因工程四要素:目的基因、工具酶、载体、受体细胞
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工
具
酶
限制性内切酶
连接酶
聚合酶 逆转录酶
激酶和磷酸酶
核酸外切酶和核酸内切酶
DNA酶和RNA酶
甲基化酶
拓扑异构酶
蛋白
思考题
1.
这些工具酶的结构特点
和功能是什么?
2. 它们在分子生物实验中
各有什么用途?
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工 具 酶—限制性内切酶
 特异地识别和结合于一段特
殊的DNA序列(二元对称)
 多数限制性内切酶识别长度
为4-6个核苷酸,少数识别更
长的核苷酸序列
 切割双链DNA
 切割后形成平端或粘端
BamHⅠ
↓
5’NNGGATCCNN3’
3’NNCCTAGGNN5’
↓
↑
5’NNGGOH + pATCCNN3’
3’NNCCTAp
HOGGNN5’
HindⅢ
↓
5’AAGCTT3’
3’TTCGAA5’
↑
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注:
 不同的酶、不同厂家生产的同一种酶的消化条件不同,没有经验时参阅
说明书
 星号酶活力
 限制酶识别位点与大肠杆菌dam、dcm甲基化作用位点重叠时
dam:
表示限制性酶切时dam甲基化作用抑制
dcm:
表示限制性酶切时dcm甲基化作用抑制
(-):
表示以上两种甲基化作用均无影响
(?):
表示甲基化的影响未见报道
 许多限制性内切酶在离开识别序列一段距离的地方切割,其切割位点用
括号内的数字来表示。如:HgaI GACGC(5/10)
 切割消化条件不利于碱基间形成氢键而连接则相反
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工 具 酶—连接酶
 粘端、平端DNA或切口的连接: T4噬菌体DNA连接酶
5’pApCpGoH
3’TpGpCpTpTpApAp
Mg2+ ATP
pApApTpTpCpGpT3’
oHG pCpAp5’
↓T DNA连接酶
4
5’pApCpGpApApTpTpCpGpT3’
3’TpGpCpTpTpApApGpCpAp5’
单链DNA或RNA的连接:T4噬菌体RNA连接酶
热稳定DNA连接酶
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DNA聚合酶
DNA 聚合酶I(全酶)
5’-3’DNA聚合酶活性
切口平移法标记
3’-5’外切酶、5’-3’外切酶
3’末端标记
5’-3’DNA聚合酶活性
末端补平、末端标记
3’-5’外切酶
cDNA第二链的合成
T4噬菌体DNA聚合酶
外切核酸酶活性比Klenow片段活
性高200倍
体外诱变、末端标记
T7噬菌体DNA 聚合酶
5’-3’DNA聚合酶活性
体外诱变、末端标记
Klenow片段
3’-5’外切酶
热稳定DNA聚合酶
聚合酶活性、5’-3’外切酶
PCR、DNA序列测定
反转录酶
以RNA为模板合成DNA
cDNA的合成
依赖于DNA的RNA 聚合酶
以DNA为模板合成RNA
合成单链RNA做探针
末端转移酶
在2价阳离子存在时催化dNTP加于 cDNA末端加同聚尾
DNA分子的3’羟基端
末端标记
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激酶和碱性磷酸酶
DNAOH5’
或RNAOH5’
T4噬菌体
多核苷酸激酶
[r-32p]ATP
5’[32p]DNA或
5’[32p]RNA
+
ADP
二硫苏糖醇
Mg2+
32P标记DNA5’末端,磷酸化5’末端
5’pDNA
5’pRNA
碱性磷酸酶
5’OHDNA
5’OHRNA
细菌碱性磷酸酶(BAP),牛小肠碱性磷酸酶(CIP)
32P标记前去除5’磷酸,去除DNA片断5’磷酸防止自身环化
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载体
自我复制、筛选标记
具有合适的限制酶切位点
高拷贝数、小分子量、高稳定性
{
克隆载体
{
原核
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质粒载体:pUC19 、pET21a、pETBlue-2
噬菌体载体:λ噬菌体载体
M13噬菌体载体
病毒:pCAT3
人工染色体:
表达载体
真核
思考题
1. 载体的特点?
2. 都有哪些载体?
3. 每种载体在分子生物实验中的功能是什么?
4. 载体和宿主细胞之间的关系是什么?
5. 如何选择合适的载体?
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T7 promoter 311-327
T7 transcription start 310
T7 •Tag coding sequence
207-239
Multiple cloning sites
(BamH I - Xho I) 158203
His•Tag coding
sequence 140-157
T7 terminator 26-72
lacI coding sequence
714-1793
pBR322 origin 3227
bla coding sequence
3988-4845
f1 origin 4977-5432
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lac operator 3606–3625
T7 promoter 1–17
lac operator 22–42
T7 transcription start 18
multiple cloning region
276–467
(Nco I–Pac I)
His•Tag® coding
sequence 437–454
HSV•Tag® coding
sequence 395–430
lacZ start codon 491
lacZ α-peptide ORF 57–
491
E. coli promoter 541–569
f1 origin 1096–1551
bla coding sequence
1669–2526
pUC origin 3206
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受 体 细 胞
受体细胞为外源基因的克隆和表达提供特定的环境和条件
载体体系一定要与受体细胞的基因型相配
如:利用α互补筛选的载体要选择ф80 lacZ△M15基因型的受体细胞才能实
现α互补筛选
思考题
1.
受体细胞的特点什么?
2.
都有哪些受体细胞?
3.
载体和受体(宿主)细胞之间的关系是什么?
4.
如何选择合适的受体细胞?
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JM109
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菌株
可作为大多数质粒载体的受体菌,也可以用于制备M13等噬菌体载体的单链
DNA。该菌株易于培养,并且可以用较多的转化方法进行有效的转化。
DH5α
菌株
一种常用于质粒克隆的菌株。其 j80lacZ△M15基因的产物可与pUC载体编
码的b-半乳糖苷酶氨基端实现a互补,可用于蓝白斑筛选。recA1 和endA1
的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
BL21(DE3)
菌株
该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。
T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子,该
区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。
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BL21(DE3)pLysS
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菌株
该菌株带有质粒pLysS,具有氯霉素抗性。此质粒含有表达T7 溶菌酶的基因,
T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰 IPTG诱导的表达。适
合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。
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目 的 基 因 的 来 源 和 分 离

基因组文库:基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重
组DNA克隆群体

cDNA文库:将真核细胞内全部mRNA转录成cDNA并将双链cDNA和载体连
接,由此得到的cDNA克隆群体直接从特定的mRNA入手

PCR和RT-PCR

基因的化学合成

从蛋白质入手
思考题
1. 为什么需要目的基因?
2. 如何鉴定目的基因?
3. 如何获得目的基因?
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外 源 基 因 导 入 受体 细 胞
 CaCl2处理后的细菌转化或转染
 高压电穿孔
 聚乙二醇介导的原生质体转化
 原生质体融合
 细胞核的显微注射
 颗粒轰击技术
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重 组 子 的 筛 选
1. 根据重组载体的特点进行筛选:抗药性筛选法、插入失活
2. 营养缺陷型筛选法:载体上携带某些营养成分基因而受体菌缺失
3. 限制性酶切分析
4. 核酸杂交:原位杂交、Southern、Northern
5. PCR
6. 表达产物的检测:电泳、测活、蛋白印迹
7. 序列测定
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分子生物学实验室常用仪器设备
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温度控制系统--冰箱:4 0C、-20 0C、-70 0C
样品、试剂和材料等的保存
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恒温培养箱
细菌平板的培养
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恒温空气摇床
菌体的培养
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灭菌器
培养基、试剂、耗材等的灭菌
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PCR 仪
PCR 扩增、保温实验等
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恒温水浴及微量加热器
保证实验温度的恒定
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电泳槽
核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架
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电 泳仪
电泳时提供电压和电流
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凝胶成像系统
电泳结果的定性和
定量分析
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台式高速冷冻离心机
样品的分离
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落地式高速冷冻离心机
样品的分离
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分光光度计
样品的定量测定
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超净工作台
提供洁净工作环境
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电子天平
样品、试剂等的称量
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pH 计
精确的pH值测定
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移液器
液体试剂的精
确取量
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实验规范训练-仪器的操作
要求:仪器在未经培训前,不得擅自使用
严格按操作规程使用仪器,
有些仪器必须有教师在场时才能使用,并由教师操作
违反规定的使用者,造成的后果由使用者承担
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实验规范训练-量程的选择
天平
烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶--不同规格
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量程的选择-移液器
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实验规范训练-标签
1.
所用的器皿上一定要做标记
2.
标签一定要贴到固定的位置
3.
标签上应包括具体的名称、组别、实验班、日期
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实
验
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规
范-实验操作
1.
详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告
2.
实验中一定要处处用心、勤动手,多问为什么
3.
仔细操作和观察
4.
保留好每一步的实验样品,在确准的情况下才能当废液扔掉
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实
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验
准
备
 清点和熟悉常用玻璃器皿、耗材等
 洗涤本学期实验用玻璃器皿
 配试剂
1. 0.1 mol/L CaCl2 100 mL
2. 5 mol/L NaOH
100 mL 胶塞
3. LB液体培养基
100 mL
胰蛋白胨(typtone)
1g
酵母提取物(yeast extract)
0.5g
NaCl
1g
加部分水溶解后加20μL 5 mol/L NaOH,定容到70 mL( 40 mL到两个
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250mL锥形瓶,3 mL分别到大试管中,用于预培养及复苏)
4. 10%(w/v)SDS储液 50 mL ,室温保存
5. 1 mol/L Tris
200 mL
6. 2 mol/L HCL
100 mL
7. 0.5 mol/L EDTA
100 mL
80 mL水中加18.61g EDTA-Na2H2O,用NaOH调 pH 8(约需2g
NaOH),后定容至100 mL
8. 5xTBE
9. 75%乙醇
1000 mL
500 mL
10. Amp :50 mg/ mL
20ml,
分装每管 1 mL,-200C保存
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注意:先将所需烧杯、量筒、玻棒、双蒸水、小指管灭菌待温度降到室温后,
在超净台中配制,再用一次性滤器过滤分装于1.5 mL无菌小指管中,用
封口膜封口于 -200C保存
 高 温 灭 菌
1. LB液体培养基
2. 50mL离心管
2个/组
3. 枪头/2组 :5mL 6支,1mL 1盒,200uL 1盒
4. 培养皿
6. 无菌水
6套/组
100
mL /班
5. 1.5mL 50个/2组
7.
0.1 mol/L CaCl2
8. 烧杯、量筒、玻棒、小指管(配Amp组准备)
明天上午7:45收灭菌的东西及平板,下周三下午接菌预培养
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大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化
时间安排
时
间
实
验
内
容
8:00-8:30
接菌
8:40-10:30
培养2.5-3小时、讲解本实验的基本原理及相关知识
10:30-11:30
培养2.5-3小时、配试剂、灭菌、准备下次实验
11:30-12:30
午饭
12:30-14:00
感受态细胞的制备
14:00-15:00
转化
15:00-17:00
复苏、铺Amp抗性平板、复苏细胞涂平板
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ApaLI (178)
P(BLA)
受体菌:
ALPHA
ApaLI (2367)
EcoRI (397)
AvaI (413)
E.Coli DH5α
R-,
Amps,
Xma I (413)
M-,
Tcs
Sma I (415)
APr
外源质粒:
Puc18/19
Bam HI (418)
pUC19
PstI (440)
2686 bp
HindIII (448)
P(LAC)
ORI
ApaLI (1121)
Ampr抗性基因编码一种周质酶(β-内酰胺酶)可特异地切割Amp的β-内
酰胺环,从而使其失去杀菌能力
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Experiments of Molecular
基 本 原 理
 感受态(Competence): 细菌处于容易吸收外源DNA的状态
 转化(transformation): 异源DNA分子导入受体细胞的过程
 致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作
 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗DNA酶的
羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细胞吸
收DNA复合物
 复苏:细菌在非选择性培养基上保温一段时间,使抗性的表型表达后再转到
含抗性的选择性培养基上,长出来的菌落即为转入了外源基因的菌落
 转化的确切机制还不清楚
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感受态细胞的制备:
Experiments of Molecular
实验流程
1. 预培养:接一单菌落到3mL LB培养基中,370C、190rpm振荡培养过夜
2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中, 370C、
250rpm振荡培养2.5-3小时(OD600 0.4-0.5)
3. 将菌液转移到50mL离心管中,冰上放置10min
4. 离心 6000rpm ,40C,10min
5. 到出培养液,将管倒置使培养液流尽
6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 10mL,轻吹并悬浮细胞,冰上
30min
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Experiments of Molecular
7. 离心 6000rpm ,40C,10min,去上清
8. 用冰预冷的0.1M的CaCl2 2mL用枪轻吹悬浮细胞,冰上操作
9. 分装细胞,200uL/份,此为感受态细胞(可于-700C或-200C冻存)
转化及复苏
1. 取 200uL感受态细胞,加入DNA(PUC19)2uL(50ng)
取 200uL感受态细胞,加入2uL无菌水(阴性对照1)
取 200uL 0.1 mol/L的CaCl2,加入DNA(PUC19)2uL(50ng)
(阴性对照2)
用枪头混匀,冰上放置30min
阴性对照的目的?
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Experiments of Molecular
2. 420C循环水浴热激90秒
3. 冰浴2分钟
4. 每管加800uL LB液体培养基,370C慢摇1小时( 150rpm )
5. 100uL或50uL已复苏的感受态细胞,涂布在含Amp的培养皿中
6. 倒置培养过夜( 370C)
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Experiments of Molecular
影响转化效率的因素
思考题
 细菌的生长状态(5x107个/mL)
 如阴性对照中长出菌,原因?
 感受态细胞的质量
 在Amp培养板中,菌的密度过
 试剂的质量
高或培养时间过长时会在阳性
 外源DNA的质量与数量
菌的周围长出一些小的卫星菌
 器皿的洁净度
落,它们是Amps的,
 污染—尽量所有打开器皿盖的
操作都在超净台中进行
原因?
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配试剂
1. LB固体培养基
Experiments of Molecular
100 mL
灭菌后待温度降到600C左右,加入Amp,立即铺平板
2. 溶液 I
50 mL 分成四份
3. 溶液III
50 mL 分成四份
4. TE
50 mL 灭菌后分装于小管中-200C冰箱保存
5. 氯仿:异戊醇=24:1
300 mL
分成四份(棕色瓶)
6. 酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 200 mL 棕色瓶分成四份(棕色瓶)
(注:试剂2-6为下一个实验的试剂,本周准备)
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Experiments of Molecular
灭 菌
1. LB固体培养基
2. 溶液I,溶III
3. TE
4. 小指管:1.5 mL 、2 mL 各40个/2组,0.5 mL20/2组
5. 枪头:200uL、 1 mL各1盒/2组
明天上午7:45收灭菌的东西及平板,下周三下午接菌预培养
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Experiments of Molecular
质粒DNA的提取及其定性定量分析
时间安排
时
间
实
验
内
容
8:00-9:30
讲解本实验的基本原理及相关知识
9:40-13:30
质粒DNA的提取
13:30-16:00
电泳、测OD26O和 OD280
16:00-17:00
准备下次实验、灭菌
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Experiments of Molecular
质粒DNA提取的相关知识
质粒的特性:共价、闭合、环状的小分子量DNA
如何去除下列物质?
蛋白
基因组DNA
RNA
糖类
脂类
小分子物质
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Experiments of Molecular
 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学
上的差异来分离它们,在碱性pH,DNA变性,恢复中性时,线性
染色体DNA不能准确复性,与其它大分子共沉淀,而质粒DNA却
可以准确复性,留在上清中
 几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价
闭合环状这两个特性
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Experiments of Molecular
核酸的凝胶电泳
 电泳:带电粒子在电场中的涌动现象
 丙烯酰胺凝胶电泳
5bp—500bp(分辨率高,1 bp)
 琼脂糖凝胶电泳
200bp—50kb(分离范围广、方便)
 琼脂糖介质结构均一,含水量大(98-99%),可通过调整琼脂糖的浓度改
变孔径的大小,起到分子筛的作用
 核酸为两性分子,在pH 3.5时,碱基上的氨基解离而磷酸基团中只有第一
个磷酸解离,整个分子带正电; pH 8左右时,碱基几乎不解离,而磷酸
全部解离,整个分子带负电
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在碱性环境下,不同的核酸
分子由于具有相同的磷酸戊
糖结构,几乎具有相同的电
荷密度,其电泳行为与SDS-
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胶浓度(%)
线性DNA分离范围
(kb)
0.3
5-60
0.6
1-20
0.7
0.8-10
0.9
0.5-7
1.2
0.4-6
1.5
0.2-4
2.0
0.1-3
PAGE类似,线性分子在凝胶
中的迁移率与其所含碱基对
数目的对数值成反比。可以
近似用于估算分子的大小
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影响迁移率的因素
Experiments of Molecular
常用电泳缓冲液
DNA分子的大小
0.5 X TBE
琼脂糖凝胶的浓度
1 X TAE
5X 储液
50X 储液
DNA的构象
所加电压
一般5V/cm
凝胶载样(上样)缓冲液
电场方向
(loading buffer)
染料的存在与否
增加样品密度
电泳缓冲液的组成
使样品带颜色,起指示作用
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Experiments of Molecular
胶浓(%)
溴酚蓝
二甲苯青
0.6
1kb
1
0.6kb
2kb
1.4
0.2kb
1.6kb
2
0.15kb
常用染料
EB:
溴化乙锭,加入胶中或电泳后染色。 EB插入核酸碱基平
面,吸收紫外光的能量产生荧光,荧光的强度与DNA的量
在一定范围内成正相关
SYBR:
新型低毒,高灵敏度荧光染料,可直接加入样品中,
价格较昂贵
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Experiments of Molecular
核酸定量
紫外吸收法
比尔-朗伯定律:ODλ =
双链DNA:
єc
1 OD260 = 50 ug/mL
单链DNA和RNA: 1 OD260 = 40 ug/mL
单链寡核苷酸: 1 OD260 = 33 ug/mL
优点:快速,不破坏样品
缺点:灵敏度低,要求样品较纯
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Experiments of Molecular
OD260/OD280:
用于表示蛋白制品被核酸污染的程度,也可用来表示核酸被蛋白
污染的程度,但核酸的消光系数较高,只有存在较多的蛋白污染时才能
反应出来
纯DNA:
OD260:OD280 = 1.8
纯RNA
OD260:OD280 = 2.0
纯蛋白: OD260:OD280 = 0.57
EB或其它染料染色法: 设置标准样品
较纯样品:直接测OD260
含较多杂质:EB或其它染料估测
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Experiments of Molecular
实 验 流 程
质粒DNA的提取
接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中

370C,190rpm振荡培养过夜

6000rpm、离心2min,收集菌体

100uL溶液I悬浮菌体(充分振荡),室温10min

加入200uL溶液II(振荡混匀),冰上静置5min裂解菌体
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
加入150uL溶液III(振荡混匀),冰上静置15min质粒DNA复性

12000rpm,离心15min

上清加等体积的酚:氯仿:异戊醇(振荡混匀)

12000rpm,离心15min

上清加等体积的氯仿:异戊醇(振荡混匀)

12000rpm,离心15min

上清加2倍体积的无水乙醇(充分混匀),-200C 30min

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Experiments of Molecular
12000rpm,离心15min

沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次(振荡混匀、离心)

12000rpm,离心10min

沉淀超净台中风干

沉淀用20uL RTE溶解,-200C保存
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Experiments of Molecular
质粒DNA的电泳鉴定
1%琼脂糖凝胶 20mL (用buffer配)
0.5xTBE
100mL
2uL质粒DNA
+ 1uL 10xloading + 1uL SYBR + 3 uL无菌水
80伏恒压电泳
结果用凝胶成像仪分析照相
质粒DNA的定量分析
质粒DNA稀释200倍(用TE缓冲液稀释),总体积300uL
灭菌: 1mL、200 uL枪头 各一盒/ 2组
0.2mLPCR管 30个/全班,1.5mL小指管 30个/2组
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Experiments of Molecular
PCR基因扩增及扩增产物的回收
时间安排
时
间
实
验
内
容
8:00-9:00
准备PCR扩增反应体系
9:00-10:30
PCR扩增、讲解本实验的基本原理及相关知识
10:30-12:30
PCR扩增、准备电泳凝胶和下次实验试剂
13:00-14:30
电泳
14:30-17:00
PCR扩增产物的回收、灭菌
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模板
5’
3’
Experiments of Molecular
3’
5’
高温变性
引物对
低温退火
中温延伸
不断循环
目的片段
聚合酶链式反应示意图
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Experiments of Molecular
基本原理
 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),即PCR技术
在合适条件下,这种循环不断重复,前一个循环的产物可作为后
一循环的模板参与DNA的合成,最终使产物DNA的量按2n方式扩增
 理论上讲经过30次的循环反应,DNA扩增倍数为106~109
PCR的特点: 特异性高、灵敏度高、快速、简便、无放射性、既可
扩增DNA也可扩增RNA
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反应体系
 模板:DNA或RNA
 引物:sense 和 antisense
 Taq酶:耐热DNA聚合酶
 dNTP Mixture
底物
 PCR buffer: 10mmol/L Tris-HCl pH8.4(200C)
50mmol/L KCl
Mg2+
0.1mg/mL乙酰BSA
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Experiments of Molecular
引物的设计的总原则:扩增的效率和特异性
 长度:15—30bp
 碱基尽可能随机分布(G+C含量 45-55%)
 引物内部不能形成二级结构
 两引物间不应有互补链存在
 3’端一定要与模板严格配对
 5’端可引入突变,加酶切位点等
辅助软件:Primer 5,Oligo,DNAsis等
引物Tm:DNA分子一半为单链,另一半为双链时的温度称为该复合体的溶解
温度Tm,与G+C含量有关
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PCR引物设计
AKP
引物1
CDS
CDS
554......2038
5’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3’
BamH1
5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…
…………………………………………………………………………. ……
……………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………….
CDS
引物2
….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’
HindⅢ
3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’
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Experiments of Molecular
扩增条件的优化
 优化反应参数:退火温度和时间、变性温度和时间
 优化Mg2+浓度
 模板的纯度,优化模板浓度
 优化dNTP的浓度
 优化引物浓度
 PCR仪:热盖、升降温速度、精度
 PCR管的质量等
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PCR扩增产物的分析
琼脂糖凝胶电泳分析
PCR扩增产物的回收
 回收的方法很多,主要目
Experiments of Molecular
PCR的应用
 目的基因的获得
 基因组克隆
 DNA序列分析
的是去除Taq酶等,取出目
的DNA片段进行后续操作
 低熔点琼脂糖法
 离心柱过滤
 离心柱吸附
 玻璃奶吸附
 RNA分析
 基因突变
 基因组的比较研究
 医学疾病诊断等
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实验流程
PCR扩增
2.5mmol/L dNTP Mixture
2.0uL
10xbuffer Mg2+Free
2.5uL
Ex-Taq E
1uL(1U)
10pmol/uL sense
1uL
10pmol/uL antisense
1uL
模板DNA
1uL
MgCl2(25mmol/L)
1uL
ddH2O
16.5uL
940C,2’ 940C,1’ 420C,1’ 720C,2’ 720C,10’
|-----------30 cycles----------|
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PCR产物的电泳
 1xTAE
Experiments of Molecular
150mL
 0.8%琼脂糖凝胶 20mL(用1xTAE配)
 25uL PCR产物 + 3uL 10xloading(含SYBR荧光染料)
 80伏恒压电泳
PCR产物的回收(玻璃奶吸附法)
1. 切胶、称胶重
2. 每100mg胶加入300uL溶胶液,500C溶胶(一定要溶解)
3. 将在-200C冻存的玻璃奶解冻,振匀!!
4. 在溶解后的胶液中加入10uL玻璃奶,吹打均匀,冰浴沉淀10min
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Experiments of Molecular
5. 10,000 rpm,离心1min,弃上清
6. 在离心所得沉淀中加入200uL稀释液,吹打均匀,10,000 rpm离心1min,
去上清,如此洗两次(稀释液:3倍体积浓缩洗胶液加入7倍体积无水乙
醇)
7. 超净台中凉干(也可在500C干燥)
8. 加入20uL TE,吹打均匀,600C 保温5-10min,12,000rpm离心2min,收
集上清(检测是否含有DNA ),-200C保存
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Experiments of Molecular
配试剂:
1. 组织匀浆液
100 mL
10mmol/L Tris-HCl
pH 8.0
25mmol/L EDTA
100mmol/L NaCl
2. 酶解液
30 mL (灭菌后再加蛋白酶K和SDS)
20mmol/L Tris-HCl
50mmol/L EDTA
200mmol/L NaCl
200ug/mL蛋白酶K
1%SDS
pH 8.0
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3. 生理盐水
Experiments of Molecular
1000 mL
4. 3mol/L NaAc pH 5.2
30 mL
先用15 mL水溶解固体NaAc 再用3mol/L乙酸调pH 5.2,最后定容
(试剂1-4为下一个实验的试剂,本周准备)
灭菌
试剂1-4
枪头: 1mL 、200uL 各一盒
小指管:
2.0、0.5mL各20个
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Experiments of Molecular
DNA重组-限制性酶切和连接
哺乳动物基因组DNA的分离
时间安排
时
间
实
验
内
容
8:00-8:30
准备限制性酶切反应体系
8:30-10:30
370C酶解3小时、讲解本实验的基本原理及相关知识
10:30-12:00
370C酶解3小时、准备下次实验、灭菌
12:00-15:00
纯化酶切载体和目的基因、连接反应
15:00-17:00
哺乳动物基因组DNA的分离(到酶解过夜)
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Experiments of Molecular
DNA 重 组
DNA重组: 外源DNA分子与载体的连接,即将外源目的基因装进载体的过程
酶切
连接
转化
筛选
重组方法
类
型
要
求
特
点
平端
高浓度的连接酶
限制酶位点消失,效率低,有串联拷贝
不同粘端
载体酶解后需纯化
限制酶位点保留,单向插入,常用
相同粘端
用磷酸酶去掉5’-磷
酸
限制酶位点保留,有串联拷贝和方向插
入
3’A
T-vector
PCR产物可直接克隆
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Experiments of Molecular
ApaLI (178)
P(BLA)
ALPHA
ApaLI (2367)
EcoRI (397)
AvaI (413)
Xma I (413)
Sma I (415)
APr
Bam HI (418)
pUC19
PstI (440)
2686 bp
HindIII (448)
P(LAC)
ApaLI (178)
ORI
P(BLA)
EcoRI (397)
ApaLI (2918)
AvaI (413)
Xma I (413)
ApaLI (1121)
酶 切
Sma I (415)
APr
P(LAC)
ALPHA
ORI
APr
P(BLA)
连接
ÍâÔ´»ùÒò
pUC19
3237 bp
+
ClaI (869)
p UC19
ClaI (897)
2686 bp
ClaI (996)
转化
Amp+
筛
选
P(LAC)
ORI
ApaLI (1672)
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Experiments of Molecular
影响重组效率的因素
思考题
 酶切效果
 若无阳性克隆,原因?
 载体和目的基因的比例
 如阴性对照中长出菌,
 细菌的生长状态(5x107个/mL)
 感受态细胞的质量
原因?
 在Amp培养板中,菌的密度
 试剂的质量
过高或培养时间过长时会在
 外源DNA的质量与数量
阳性菌的周围长出一些小的
 器皿的洁净度
 污染—尽量所有打开器皿盖的
操作都在超净台中进行
卫星菌落,它们是Amps的,
原因?
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重组子的筛选
1.提取质粒,酶切,电泳验证
2.抗药性筛选法,插入失活
3.营养缺陷型筛选法
4.杂交法:原位杂交,Southern
5.测序
6.表达产物的检测:测活、电泳、蛋白印迹
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7、 α互补
 载体中引入LacZ’基因,包括LacZ的调控序列和编码氨基端146Aa
( α-肽)的序列,表达产物无活性,而在受体细胞中,染色体DNA
上含有LacZ的编码β-半乳糖苷酶羧基端的序列,其产物也无活性。
二者结合才能有全酶的活性—α-互补。将无色的5-溴-4氯-3-吲哚D-半乳糖苷(x-gal)底物水解为蓝色的5-溴-4-靛蓝
 在146Aa( α-肽)编码区中插入了一个多克隆位点且不破坏其阅读
框,当有外源基因插入时,则无完整的α-肽生成, β-半乳糖苷酶
无活性,菌落白色,而无外源基因插入时,长出蓝色菌落。 有些质
粒LacI缺失,不用IPTG诱导
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阻遏蛋白
IPTG
LacZ’
乳糖操纵子
LacA
操
纵
子
LacY
2
启
动
子
LacZ
Lac I
1
启
动
子
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实验流程
酶切反应体系
连接反应体系
管号
tube1
tube2
AKP
3uL
核酸
15uL AKP
7uL PUC18
PUC 18
3uL
10xbufferK
2uL
1uL
10x ligase buffer
1.0uL
ddH2O
1uL
0
BamHI
1uL
1uL
HandIII
1uL
1uL
T4 DNA
ligase
ddH2O
 370C酶解3小时

分别将tube1和tube2中的样品先加入1/10体积的3mol/L
NaAc(pH5.2),再加2倍体积的无水乙醇,-200C沉淀30分
钟,12000rpm离心15min
0.5uL
2.5uL
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 沉淀再用75%乙醇洗涤, 12000rpm离心15min,干燥后加5uLTE溶解

产物按连接反应体系进行连接反应
感受态细胞的制备:见前面的实验
转化及复苏
1. 取 200uL感受态细胞,加入10uL连接产物
取 200uL感受态细胞,加入2uL无菌水(对照1)
取 200uL 0.1M的CaCl2,加入5uL连接产物 (对照2)
用枪头混匀,冰上放置30min。
阴性对照的目的?
2. 420C循环水浴热击90秒,冰浴2分钟
3. 每管加800uL LB液体培养基,370C慢摇(150rpm)1小时
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4. 在预制的LB琼脂平板上,加40uL Xgal(20mg/mL )和40uL IPTG
(20mg/mL)溶液,均匀涂布于琼脂平板表面
5. 100uL或50uL已转化的感受态细胞,涂布在上述含Amp的培养皿中,平板向
上静置30min
6. 倒置培养过夜( 370C)
重组子的筛选
抗性筛选
蓝白斑筛选
提取比较重组质粒的大小
酶切鉴定:观察是否含有已知大小的重组的目的基因片段
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哺乳动物基因组DNA的分离及其定性定量分析
提纯的思路
1. 基因组DNA的特性:分子量较大、易断(如何保证DNA分子的完整性?)
2. 组织和细胞的破碎
3. 要去处的物质:
蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质
所提取的DNA片段的大小:100 — 150kb
用途:Southern杂交、基因组DNA文库的构建
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实验流程
基因组DNA的提取:
0.2g鼠肝,冰冷生理盐水洗3次,剪碎

碎鼠肝转入玻璃匀浆器中,加入2mL匀浆液,匀浆6次(冰上操作)

匀浆液转入2mL小指管,40C , 5000rpm离心2min,

沉淀加0.4mL无菌水,吹散,再加0.4mL酶解液,慢慢颠倒混匀

550C 水浴酶解过夜,40C存放

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加RNase ,终浓度200ug/mL,370C保温60min

加等体积酚/氯仿/异戊醇,慢慢颠倒混匀,冰上平倒静置10min

40C,10000rpm离心10min,用扩口枪头取出上清

上清加等体积氯仿/异戊醇,慢慢颠倒混匀

40C,10000rpm,用扩口枪头取上清

上清加1/10体积的NaAc和加2倍体积的无水乙醇
慢慢混匀,-200C静置30min
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Experiments of Molecular

12000rpm离心15min,弃上清

沉淀用1mL 75%冷乙醇洗两次,每次12000rpm离心10min,弃上清

超净台中干燥加 50uL TE, 40C溶解过夜,-200C保存
电泳:
0.3%琼脂糖凝胶 20mL(用TBE配)
4uLDNA + 5uLH2O + 1uL 10xloading(含荧光染料SYBR)
80伏恒压电泳,凝胶成像仪观察和分析结果
基因组DNA的定量分析:
基因组DNA稀释300倍(用TE缓冲液稀释),总体积300uL
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配试剂:
1. 0.1mol/L的CaCl2
2. LB液体培养基
Experiments of Molecular
100mL
110mL
胰蛋白胨(typtone)
1.1g
酵母提取物(yeast extract)
NaCl
0.55g
1.1g
加部分水溶解后加22μL 5mol/L NaOH,定容到120mL
两个40ml到250mL锥形瓶 , 其余的分装到大试管中(3 mL/ 管)
3. LB固体培养基
100 mL
LB液体培养基中含1.5%的琼脂
灭菌后待温度降到600C左右,加入Amp,立即铺平板
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Experiments of Molecular
灭菌
1. 试剂1-3
2.小指管: 2.0、 1.5 mL各40个/2组
0.5 mL小指管20/2组
3. 枪头:200uL
4. 50 mL离心管
1盒/组
1mL 1盒(扩口枪头30个)/组
2个/组
明天上午7:45收灭菌的东西及平板,下周三下午接菌预培养
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Experiments of Molecular
DNA重组-重组子的转化
哺乳动物基因组DNA的分离(续)
时间安排
时
间
实
验
内
容
8:00-8:30
接菌
8:40-10:30
培养2.5-3小时、基因组DNA的分离
10:30-11:30
培养2.5-3小时、基因组DNA的分离、准备电泳凝胶
11:30-12:30
午饭
12:30-17:00
感受态细胞的制备、重组子的转化、复苏、涂平板、电泳
并观察结果、配试剂灭菌
明天上午7:45收灭菌的东西及平板,下周三下午接菌预培养
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Experiments of Molecular
灭菌
小指管: 2.0、 1.5 mL各40个/2组
0.5 mL小指管20/2组
3. 枪头:200uL
1盒/组
1mL 1盒/2组
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DNA重组-重组子的筛选
重组子转化表达菌株
时间安排
时
间
实
验
内
容
8:00-8:30
接菌(表达菌株)
8:40-12:00
培养2.5-3小时、质粒DNA的提取、准备电泳凝胶
12:00-15:00
质粒DNA的限制性酶切,电泳并观察结果
12:30-17:00
感受态细胞的制备、重组子的转化、复苏、涂平板、配试
剂灭菌
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配试剂灭菌
1. TM液体培养基
40mL
2. 枪头
200ul
1盒
1ml
1盒
明天上午7:45收灭菌的东西及平板,下周三下午接菌预培养
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Experiments of Molecular
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
时间安排
时
间
实
验
内
容
8:00-8:30
接菌
8:30-10:30
菌体培养、讲解本实验的基本原理及相关知识
10:30-11:20
配试剂和准配实验
11:20-16:00
加IPTG,诱导表达4.5小时
13:00-16:00
设计实验讨论
16:00-17:00
离心
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ATG
DNA
TAA
RNA
Protein
大肠杆菌中基因表达的重要信号
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启动子和载体系统
受IPTG诱导的表达载体
lac启动子:如PUC,pGEM,pSK等,表达的蛋白与β-半乳糖苷酶氨
基端融合。更大程度的诱导lac启动子需CAP(crp基因产物,cAMP激
活蛋白)参与,不能用以葡萄糖为炭源的培养基
阻遏蛋白
多克隆位点
IPTG
LacZ’
启动子1
Lac I
启动子2
操作子
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trp-lac(tac或trc)启动子:
由trp启动子-35区和lacUV5启动子-10区融合而成,受lacI阻抑物
调控而不受CAP介导的cAMP调控机制的调控。如:pKK223-3
T7噬菌体启动子:
 在含T7噬菌体启动子的载体中,外源基因的表达受T7噬菌RNA聚合酶调
控
 带有colE1复制区,带有Amp或Kan抗性
 表达效率高
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pET系统调控元件
IPTG诱导
大肠杆菌
IPTG诱导
LacO
T7RNA聚合酶
T7基因1
RNA聚合酶
LacO
T7RNA聚合酶
灭活
Lac启动子
T7启动子
DE3
T7溶菌酶
Lac阻遏物
pLysS
or E
LacI
大肠杆菌基因组
T7溶菌酶基因
Lac阻遏物
LacI
pET
靶基因
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Biology
受温度诱导的表达载体: PL启动子
λ噬菌体PL启动子受温度敏感型阻抑物cIts857调控,cIts857在低
温下能抑制PL驱动的转录,而高温则不能
如:pHUB系列,pPLc系列等
cIts857+宿主
420C
PL
靶基因
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融合表达载体
 将两个或多个开放阅读框架按一定的
顺序连在一起表达成一个杂和蛋白
 靶蛋白连接在运载蛋白的N-端或C-端
 GST系统: 将GSTs(谷光苷肽S-转移
酶)与外源蛋白融合表达后,可用
运载序列
切割序列
多克隆位点
启动子
ATG
GST-琼脂糖柱纯化,用GST或蛋白酶
洗脱
 聚组氨酸-Ni系统: 将外源蛋白与
聚组氨酸融合表达,暴露的多聚组氨
酸能结合于固化Ni树脂,用酸性米唑
洗脱
融合表
达载体
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 靶蛋白附着于已知酶功能和/或抗原组成的结构域,有利于靶蛋白的
标记与纯化
 靶蛋白与信号肽相连,可以将融合蛋白分泌到特定的细胞区
 运载蛋白能保护靶蛋白免受原核宿主的蛋白酶降解
 运载蛋白可以改变靶蛋白溶解性,防止形成不溶性包涵体
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表达系统:
Experiments of Molecular
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌
哺乳动物细胞、昆虫
酿酒酵母、植物
 实验中,要根据所要表达的蛋白质的大小、蛋白质的需要量、是否需
要活性以及实验室的条件等综合考虑选择合适的宿主-载体系统
 大肠杆菌遗传图谱明确,容易培养,费用底,已有许多成功的先例,
是首选的表达系统,但大肠杆菌中缺少翻译后修饰系统,一些修饰后
才有活性的蛋白必需选择真核细胞为宿主
分离基因
优化表达条件
构建载体
转化
筛选鉴定
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表达条件的优化

翻译效率的优化: 启动
ATG和SD序列之间的距离(5-7个核苷酸)
翻译起始区的二级结构------减少SD序列核苷酸之间的二级结构
 密码子的使用:
 培养条件的优化:
 可溶性表达
 不溶性表达
 融合表达
 非融合表达
稀有密码子和密码子的偏倚性
培养温度、诱导物的浓度、培养基的组成和pH等
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实验流程
1.
预培养:接一单菌落到3mL含Amp的LB培养基中,370C、190rpm振荡
培养过夜
2. 取 0.5mL菌液转移到50mL含Amp的LB液体培养基的锥形瓶中,
370C、250rpm振荡培养3小时,至OD600 0.7-0.8
3. 加入IPTG(40ug/mL)
4. 继续在370C、250rpm振荡培养4.5小时
5. 离心 6000rpm ,40C,10min
6. 沉淀在-200C冻存
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配试剂和准配实验
1、0.1%DEPC
2、4mol/L
Experiments of Molecular
4、4mol/L LiCl
1500mL
异硫氰酸胍
3、2mol/L NaAc
pH 4.8
4、4mol/L LiCl
20 mL
5、3mol/L NaAc
pH 5.2
5、3mol/L NaAc
50mL
30mL
6、 1.5 mL 小指管
20个
0.5 mL 小指管
10个
7、 枪头
30mL
(试剂2-5均用 0.1%DEPC配制 )
灭菌
1、0.1%DEPC
200uL
1盒
1mL
1盒
5mL
6支
8、 50mL离心管
20mL
9、研钵
2、4mol/L
异硫氰酸胍
3、2mol/L
NaAc
pH 4.8
pH 5.2
三个
一套,剪刀一把
(剪刀、研钵、耗材等均用
0.1%DEPC处理后再灭菌)
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植物总RNA的提取及其定性定量分析
时间安排
时
间
实
验
内
容
8:00-9:00
讲解RNA提取的基本原理及相关知识
9:10-15:30
RNA提取,配制RNA电泳的琼脂糖凝胶
15:30-17:00
RNA电泳, 测定紫外吸收,准备下次实验
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为什么要提取RNA?
 目的基因的获得
 TR-PCR
 Northern杂交
 CDNA克隆
 核酸酶保护实验
 体外转译
 差异显示等
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RNA有哪些特性?
 核糖核酸
 核蛋白体
 不稳定性,易被降解
 不均一性:
rRNA
mRNA
tRNA及小分子RNA
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目标:
Experiments of Molecular
保证分离RNA的完整性、纯度、产率
 尽量简化操作步骤、缩短提取过程、以减少各种有害因素对RNA的破坏、
降低杂质的污染到最低程度等
 RNA的降解:物理、化学、酶学--RNA酶(外源:环境、器皿、耗材、
试剂;内源:组织本身含有的RNA酶 )
 试剂专用,最好使用新开封的,分小份保存试剂,用后丢弃
 器皿、耗材、取液枪专用
 勤换手套等
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如何破坏RNA酶的活性?
 变性剂: 异硫氰酸胍、苯酚、氯仿等
 抑制剂: DEPC、氧钒核糖核苷复合物、RNA酶蛋白抑制剂、巯基
乙醇(或 DTT)等
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在实验之前应该考虑的问题:
 选材和取材:原核、酵母、植物、动物、组织
 破碎:物理法、化学法、酶法
 破碎后的无细胞体系含有什么:细胞残渣、核酸(DNA 和 RNA)、
蛋白质、蛋白聚糖、糖类、脂类、色素、小分子物质等
 去掉什么留下什么
 如何去掉不需要的成分--实验流程是什么
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实验流程
在一灭菌50mL离心管中加入:
4mol/L异硫氰酸胍
4mL
苯
3mL
酚
2mol/L NaAc(pH4.8)
氯仿
0.3mL
0.6mL

避光培养小麦10天

称取1.2g小麦苗的叶片,冰浴剪碎

液氮研磨叶片成粉末,转入已准备好的离心管中

混匀,冰浴30min(?)

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40C,10000rpm,15min

上清至另一离心管中

加2倍体积无水乙醇,-200C,1小时

40C,10000rpm,15min

弃上清,沉淀中加 4mol/L LiCl 1mL,吹散

移入1.5mL小管, 冰浴1小时

40C,13000rpm,15min
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
弃上清,沉淀加入400uL DEPC水,400uL氯仿混匀(?),
13000rpm,6min

上清加1/10体积3mol/L NaAc(pH 5.2),2倍体积无水乙醇混
匀,-200C,30分钟

13000rpm,15min

沉淀用70%醇洗两次,每次离心

室温稍干燥

沉淀加50uL DEPC水溶解(-200C保存)
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RNA电泳:
 制胶:1%变性琼脂糖胶
称取0.2g琼脂糖,加入DEPC水12.6mL,5×电泳缓冲液4mL,加热使溶解,
稍冷却(60-65℃)加入37%甲醛3.4mL和 4μL GelStar混匀(或电泳
完以后用EB染色),室温凝固30分钟(通风橱操作)
 7μL样品 +1μL样品缓冲液
 80V恒压电泳
测OD260 和 OD260 /OD280
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结果:
18S rRNA
1.8 Kb-2.0 Kb
28S rRNA
4.6 Kb-5.3 Kb
mRNA 0.6-5 Kb(1.5-2.0 Kb)
(80-85%rRNA,28S,18S,5S;
10-15% tRNA 及小分子RNA;
1-5% mRNA )
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思考题
1、如何分离提取脂类和糖类含量高的组织的总RNA?
2、如何分离提取RNA酶含量或活性含量高的组织的总RNA?
3、如何分离提取mRNA?
4、还有其它简单的方法提取RNA吗?
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配试剂
1. 破碎缓冲液
200mL
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4. 1.5MTris-HCl
pH 8.8,100mL
50mMTris-HCl pH 8.0
5. 0.5MTris-HCl pH 6.8, 100mL
2mM EDTA
6. 30% Acr/Bis储液 200mL
2. 测活液 30mL
过滤(棕色瓶)
50mMTris-HCl pH 8.5
7. 10% AP 10mL,-200C保存
0.2mg/ml BSA
8. 5x电极缓冲液
5mM MgCl2
10mM pNPP
3. 终止液
300mL
0.2M Na3PO4
500mL
室温存放
9. R-250染色液
(棕色瓶)
500mL
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10. 10xPBS储液
137mM NaCl + 2.7mM KCl
10mM Na2HPO4 + 2mM KH2PO4
溶于900ml水后用HCl调pH 7.4后定容到1000ml
11. 印迹缓冲液
1000mL
12. 丽春红染色液
300mL
13. 封闭液
300mL
14. 一抗
200mL
15. 二抗
200mL 用前用1xPBS 1:1000稀释
16. 显色底物
5%脱脂奶粉(用1xPBS配制)
用前用1xPBS稀释
200mL
200mL 1xPBS
150mgDAB
300uL H2O2 (用时加入)
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蛋白质印迹(Western blotting)
时间安排
时
间
实
验
内
容
8:00-10:30
制备SDS-PAGE的凝胶
10:30-11:00
电泳加样
11:00-13:30
电泳
13:30-14:30
较和NC膜进行转膜前的预处理和转膜准备
14:30-15:30
转膜
15:30-16:30
丽春红检测转膜效果、封闭2小时
18:30-21:00
加一抗和二抗
21:00-21:30
显色和观测结果
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 印迹(blotting)是70年代中后期出现的一种生化技术
 印迹类似于吸墨迹的过程
 它常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交及许多灵敏
的检测技术相匹配而进行
 广泛应用于DNA、RNA、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等多种生物大
分子的研究
凝胶电泳
转膜
固定
检测
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Biology
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
加速剂TEMED
丙烯酰胺
甲叉丙烯酰胺
T =
催化剂
a+b
m
过硫酸铵
X 100%
a:丙烯酰胺的量
聚丙烯酰
胺凝胶
C =
b:甲叉丙烯酰胺
T:丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓
b
X 100%
a+b
m:溶液的总体积
C:表示交联剂所占百分比
一般按a:b = 29:1(或29.2 :0.8)配制储液,改变T值改变胶孔径
T
分离范围(KD)
15
12-43
10
16-68
7.5
36-94
5.0
57-212
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分类
 自然胶电泳
 变性胶电泳
 等电聚焦
 梯度胶电泳
 印迹转移电泳
 双向电泳
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浓缩效应
 电泳体系为不连续体系
-
Tris-Gly pH 8.3
 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同
样品
 凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的
浓缩胶 pH 6.8
两层胶组成
浓缩后的样品
 Cl-的快速泳动在其后面形成低电
Gly- 、 Pr- 、Cl-
导,高电压梯度区带动Pr-和Gly-
分离胶 pH 8.8
快速泳动,这样在高电压与低电压
Tris-Gly pH 8.3
区形成界面,Pr浓缩成狭小薄层
 电荷效应、凝胶的分子筛效应
+
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变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
 SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键
 β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开
 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质-SDS复合物
 由于SDS带有大量的负电荷,掩盖了蛋白质原有的电荷
 SDS与蛋白质的结合,改变了蛋白质原有的构象,变成了近似于雪茄烟形
的长椭圆棒,其短轴长度一样,而长轴与分子量大小成正比
 SDS-PAGE中,SDS-蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响,
而只与蛋白质的分子量正相关
用途:亚基分子量的测定,变性蛋白的分离,蛋白纯化中的质量控制等
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转
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移
检
虹吸作用转移
印迹在载体膜上的特异抗原的检出依赖于抗原
电转移
真空转移
测
抗体亲和反应。一般经过封闭、一抗结合、二
抗结合、显色等步骤。一抗对抗原是特异的。
电极
酶标二抗是商品化的,对某种动物的一抗都可
以反应,这是因为Ig的恒定区在同一种动物Ig
同一型轻链和重链中是比较恒定的具有相同的
-
+
抗源性。
电泳缓冲液
二抗常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光
素、同位素等标记。辣根过氧化物酶的底物有
支 海
持 绵
架
凝
滤 胶
纸
NC
膜
滤
纸
槽式转移装置
DAB(二氨基联苯氨),OPD(邻苯二氨)等
2DH
+ H2O2
E
2D + H2O
显色
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实验流程
细胞破碎
酶活性分析
1. 加入15 mL匀浆液,重悬菌体
2. 超声破碎:
输出功率800w
超声 2秒
间隔10秒
管号
1
2
测活液(uL)
180
180
缓冲液(uL)
20
0
酶(uL)
0
20
300C反应10min
超声次数:30次
终止液(mL)
3. 4℃ 15,000rpm离心30min
OD410
4. 留取上清
3.8
3.8
分别做带有外源基因的菌和没
有外源基因的空菌比较差别
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电 泳
1. 洗尽胶板,架好和固定好胶板
2. 配置12%分离胶(20mL)
3. 分离胶混匀后用5mL枪头加入两玻璃夹缝中,并小心在胶面上
加入1cm蒸馏水,约20-40min后分离胶自然凝聚
4. 倾斜倒出蒸馏水
5. 配制4%浓缩胶(10mL)。
6. 在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm的梳子
7. 浓缩胶混匀后加入两玻璃夹缝并没过梳子
8. 浓缩胶凝固后小心拔出梳子,用1×电极缓冲溶液冲洗拔出梳子
后的加样凹槽底部,清除未聚合的丙烯酰胺
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9. 样品制备: 样品中加等体积的2×上样Buffer,于沸水中煮3-5min,
取出待用
10. 电泳加样:
将凝胶装入电泳槽,在槽中加入约适当的1×电极缓冲溶液
按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品和标准样品
11. 电泳:接通电源,电压设定为80V开始电泳,当样品进入分离
胶时,调节电压使其恒定在120V当溴酚蓝移动到离底部约
0.5cm时,切断电源,停止电泳
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转移及检测
1. 将胶板从电泳槽中取出,小心从玻璃板上取下凝胶
2. 凝胶和滤纸、硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少30分钟
3. 负极上铺三层和胶一样大小的滤纸,然后依次将胶和硝酸纤维素(NC)膜
铺在滤纸上,再在膜上铺三层滤纸,并压另一极上,注意不要留气泡
4. 恒流1mA/cm2,电泳转移1hr
5. 转移结束后将NC膜取出,用丽春红染色,若转膜成功,用1xPBS溶液配制的
5%脱脂奶粉封闭1小时
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6. 将封闭后的膜用1xPBS清洗3次,加入1xPBS稀释的一抗(稀释
的倍数为ELISA所测效价的1/10),加入的一抗工作液覆盖住
膜即可。室温下(或370C),轻轻摇动,孵育1hr
7. 1xPBS清洗3次后,加入按1:1000倍稀释的偶联有辣根过氧化
物酶的二抗。室温下(或370C) ,轻轻摇动,孵育1hr
8. 1xPBS清洗3次,用显色液显色至出现清晰条带,加水冲洗终止
显色反应
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mRNA差异显示
Differential display PCR,DD-PCR
通过比较来自不同样品的mRNA的cDNA片段的电泳带谱,直观、快捷地鉴
别出特异表达基因的cDNA片段,乃至最终克隆出特异表达基因
不同发育阶段特异表达基因的分析
不同环境下基因的特异表达
病理状态下基因的特异表达
分类
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mRNA
5’
RT-PCR
AAAA(A)n
特异引物
AAAA(A)n
RT
RT
Oligo(dT)
AAAA(A)n
TTTT(T)n
AAAA(A)n
AAAA(A)n
TTTT(T)n
AAAA(A)n
随机引物
RT
PCR
AAAA(A)n
PCR
PCR
DNA
3’RACE
5’RACE
cDNA文库
分析基因的表达及
表达强度等等
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反转录酶(reverse transcriptase)
RNA依赖的DNA聚合酶
禽源反转录酶来自鸟类成髓细胞瘤病毒(AMV): ,最佳反应温度420C,具有较
高的RAaseH的活性,合成的cDNA较短
鼠源反转录酶:来自鼠白血病病毒莫勒尼株(Mo-MLV)RNaseH活性相对较弱,
但最适反应温度为370C,对于具有高度二级结构的模板效率低
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Experiments of Molecular
基因组DNA
Southern杂交
DNA限制片段
DNA分子杂交是指,双股DNA分子的
变性和带有互补序列的同源单链间
的配对过程。
琼脂糖凝胶电泳
重组体筛选
转膜
基因筛选
DNA同源性检测
高盐
基因定位
NC膜
凝胶
滤纸
标记探针杂交
检测
物理图谱
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DNA 序列测定(酶法)
PCR扩增、测序酶
ddATP/dNTP
ddTTP/dNTP
ddGTP/dNTP
ddTTP
ddTTP
ddTTP
ddTTP
ddA
ddA
ddA
ddA
末端ddNTP标记链延伸和链终止
同位素标记
荧光素标记
引物标记
ddGTP
ddGTP
ddGTP
ddGTP
ddCTP/dNTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
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大肠杆菌K12碱性磷酸酶(AKP)的定点突变
大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因序列
551
601
651
701
751
801
851
901
951
1001
1051
1101
aagttgtcac
atttgtacat
tcttaccgtt
cctgttctgg
tgctcgccgt
gcgataaacc
gactcggaaa
ttttaaaggt
cgctgaataa
tcagcaaccg
cgtcgatatt
ccgcaggtct
ggccgagact
ggagaaaata
actgtttacc
aaaaccgggc
ttaacgggtg
tgcaaaaaat
ttactgccgc
atagatgcct
aaaaaccggc
cctggtcaac
cacgaaaaag
ggcgaccggt
tatagtcgct
aagtgaaaca
cctgtgacaa
tgctcagggc
atcagactgc
attattttgc
acgtaattat
taccgcttac
aaaccggact
cggtgtcaaa
atcacccaac
aacgtttcta
ttgtttttat
aagcactatt
aagcccggac
gatattactg
cgctctgcgt
tgattggcga
gccgaaggtg
cgggcaatac
acgtcaccga
acctataacg
gattctggaa
ccgcagagtt
tttttaatgt
gcactggcac
accagaaatg
cacccggcgg
gattctctta
tgggatgggg
cgggcggctt
actcactatg
ctcggctgca
gcgcgctggg
atggcaaaag
gcaggatgcc
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Biology
1151 acgcccgctg cgctggtggc
1201 gagcgcgacc agtgaaaaat
1251 aaggatcgat taccgaacag
1301 ggcggcggcg caaaaacctt
1351 gggaaaaacg ctgcgtgaac
1401 gcgatgctgc ctcactgaat
1451 ctgcttggcc tgtttgctga
1501 gaaagcaacg taccatggca
1551 caaatccgca acgtaatgac
1601 aaagccattg aattgttgag
1651 tgaaggtgcg tcaatcgata
1701 aaattggcga gacggtcgat
1751 ttcgctaaaa aggagggtaa
1801 ccacgccagc cagattgttg
1851 aggcgctaaa taccaaagat
1901 tccgaagagg attcacaaga
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acatgtgacc
gtccgggtaa
ctgcttaacg
tgctgaaacg
aggcacaggc
tcggtgacgg
cggcaatatg
atatcgataa
agtgtaccaa
taaaaatgag
aacaggatca
ctcgatgaag
cacgctggtc
cgccggatac
ggcgcagtga
acataccggc
tcgcgcaaat
cgctctggaa
ctcgtgccga
gcaaccgctg
gcgtggttat
aagcgaatca
ccagtgcgct
gcccgcagtc
ccctggcgca
aaaggctttt
tgctgcgaat
ccgtacaacg
atagtcaccg
caaagctccg
tggtgatgag
agtcagttgc
gctacggtcc
aaaggcggaa
cgttacgctt
gtgaatggca
cagttggtga
gcaaaaaccc
ggctaggacc
acctgtacgc
gatgaccgac
tcctgcaagt
ccttgtgggc
ggcgctggaa
ctgatcacgc
ggcctcaccc
ttacgggaac
gtattgcggc
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Biology
1951 gtatggcccg catgccgcca atgttgttgg actgaccgac cagaccgatc
2001 tcttctacac catgaaagcc gctctggggc tgaaataaaa ccgcgcccgg
碱性磷酸酶氨基酸序列
MSRPRLIVAL
FLFFNVFVHG
ENKVKQSTIA
LALLPLLFTP
VTKARTPEMP
VLENRAAQGD
ITAPGGARRL
TGDQTAALRD
SLSDKPAKNI
ILLIGDGMGD
SEITAARNYA
EGAGGFFKGI
DALPLTGQYT
HYALNKKTGK
PDYVTDSAAS
ATAWSTGVKT
YNGALGVDIH
EKDHPTILEM
AKAAGLATGN
VSTAELQDAT
PAALVAHVTS
RKCYGPSATS
EKCPGNALEK
GGKGSITEQL
LNARADVTLG
GGAKTFAETA
TAGEWQGKTL
REQAQARGYQ
LVSDAASLNS
VTEANQQKPL
LGLFADGNMP
VRWLGPKATY
HGNIDKPAVT
CTPNPQRNDS
VPTLAQMTDK
AIELLSKNEK
GFFLQVEGAS
IDKQDHAANP
CGQIGETVDL
DEAVQRALEF
AKKEGNTLVI
VTADHAHASQ
IVAPDTKAPG
LTQALNTKDG
AVMVMSYGNS
EEDSQEHTGS
QLRIAAYGPH
AANVVGLTDQ
TDLFYTMKAA
LGLK
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PCR引物设计(S102A)
AKP
引物1
CDS
CDS
554......2038
5’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3’
BamH1
5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…
…………………………………………………………………………. ……
……………………………………………………………………………….
引物2
引物3
……....3’CTGATGCAGTGGCTGCGCCGACGTAGTC5’ ……….......
..…CCGGACTACGTCACCGACTCGGCTGCATCAGCAACCG..…
……....5’GACTACGTCACCGACGCGGCTGCATCAG3’ ………...
……………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………….
CDS
引物4
….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’
HindⅢ
3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’
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PCR引物设计(D327A)
AKP
引物1
CDS
CDS
554......2038
5’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3’
BamH1
5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…
…………………………………………………………………………. ……
……………………………………………………………………………….
引物2
…..….3’CCACGCAGTTAGCGATTTG TCCTAGTAC5’ ……….......
…TTGAAGGTGCGTCAATCGATAAACAGGATCATGCTGCGA….
引物3
……...5’GGTGCGTCAATCGCTAAACAGGATCATG3’ …………..
……………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………….
CDS
引物4
….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’
HindⅢ
3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’
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DD-PCR
5’
mRNA
MNAAAAn 3’
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样品A
总RNA
样品B
总RNA
M:G、A、T、C
N: G、A、C
12个下游引物反转录cDNA
锚定反义引物: (T)11-12XY
X:G、A、C
Y:G、A、T、C 共12种组合
下游引物:
随机正向引物: 10 mer
每个下游引物再与一个随机引物结合进行PCR
10mer
电泳分离
克隆、测序
该项技术目前阶段还有许多问题需要解决,费钱费力,假阳性多,重复性差
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接瘤小鼠DD-PCR
一、小鼠接瘤处理
昆明鼠,体重20一22g,每只小鼠注射H22腹水肝癌细胞,癌细胞量为
1.5-2.0×106个(大约0.1 mL),接种后7一10天产生腹水(实验
前一天禁食)
二、肝脏总RNA的提取

断颈处死小鼠 ,迅速取0.4g鼠肝,放入研钵中,绞成几小块

立即加入液氮,研磨成粉末

将组织粉末转移至事先装有6ml溶液D的50ml离心管中,室温搅拌30
秒混匀,立即加入苯酚6mL、氯仿1.2mL 、0.6 mL2MNaAc(pH4.0),
剧烈振荡混匀,冰浴放置30分钟
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 4℃,12000 rpm,离心10分钟

上清水相加入等体积的异丙醇,-20℃,1小时

4℃,12000 rpm,离心10分钟,弃上清

沉淀加入0.9mL溶液D,将溶液转入小指管中,旋涡混匀,再加入等体
积的异丙醇,-20℃,1小时


4℃,12000 rpm,离心10分钟
弃上清,沉淀用1mL 75%乙醇洗涤2次,重复上述离心(75%乙醇用
DEPC水配制)

将沉淀RNA室温下稍干燥

加50μL DEPC水溶解,-20℃保存
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三、RNA的电泳检测
 1%变性琼脂糖胶
称取0.2g琼脂糖,加入DEPC水12.6mL,5×电泳缓冲液4mL,加热使溶解。
稍冷却(60-65℃)加入37%甲醛3.4mL和4μL GelStar混匀,室温凝固
30分钟(通风橱操作)
 样品的处理
2μL甲醛 + 1μL样品缓冲液 + 5μL样品,85℃温浴10min,冰浴10min
 50V恒压电泳
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四、总RNA的定量

取少量RNA样品,1:20 稀释后,分别测定280nm和260nm处的光密度值

按下列公式计算RNA的含量
[RNA](ug/ml)=稀释倍数×OD260/0.024
R = OD260/ OD280

然后用DEPC水将浓度调节至100ug/ml
(注意:石英比色皿使用前后,应在盐酸:甲醇(1:1)中浸泡后,用蒸馏
水冲洗干净)
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五、RNA中微量DNA的去除
 选取质量和纯度都较好的RNA样品(R值>1.8,电泳无降解)
 反应体系50uL
10X缓冲液
5 uL
RNase抑制剂
0.5 uL(20U)
总RNA
35 uL
无RNase的DNase
8 uL (40U)
 37℃,30min
 加入等体积的酚:氯仿(3:1),振荡混匀以破坏DNA酶,12000rpm离
心2min
 水相加入5uL3M乙酸钠pH5.2,200uL无水乙醇,-20℃30min,12000rpm
离心10min
 用500uL70%乙醇洗沉淀一次
 将RNA沉淀溶于20uL DEPC水中
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六、锚定引物反转录—cDNA第一链的制备
 3’-锚定引物:dT12GC和dT12CG
 将RNA样品用DEPC水进行连续稀释系列,使RNA在20 uL的反应体系的
总量分别为250,50ng(关键:优化RNA模板的浓度)
 反应体系20 uL
5X反转录缓冲液
4 uL
2.5mMdNTP
2 uL
10uM锚定引物
2 uL
RNase抑制剂
0.5 uL (20U)
模板(8~800ng)
Y uL
DEPC水
Z uL
先65℃5min使RNA变性,然后37℃10min使引物与mRNA退火

加入反转录酶2uL,混合均匀,37℃50min

95℃5min灭活反转录酶,立即冰浴5min,-20℃保存备用
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七、PCR扩增
PCR反应体系20 uL
2.5mM dNTP Mixture
1uL
10xbuffer Mg2+Free
2uL
10 uM锚定引物
2uL
10 uM随机引物
2uL
模板
3uL
MgCl2(25mM)
2uL
ddH2O
7.5uL
TaqE
0.5uL(2.5U)
940C,5’ 940C,30’’420C,2’720C,30’’ 720C,10’
|---------40 cycles----------|
注:做一个未经逆转录的RNA样品的PCR反应
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八、6%尿素聚丙烯酰氨变性胶电泳显示(DD-PCR结果)

制备6%的聚丙烯酰胺凝胶
6%变性聚丙烯酰胺凝胶贮液90mL,四甲基乙二胺(TEMED)60μL,10%过
硫酸胺90μL。灌满后将梳子插入胶液内,在室温聚合

样品的准备
取10 uL PCR产物与2μL 10X上样混冲液混合,90℃5min,冰浴待用

待胶聚合后,加入1X TBE电极液,将梳孔中的尿素冲洗干净

将上述处理好的样品加入梳孔中

120V电泳约3h,直至溴酚蓝染料接近底部

电泳结束后,小心揭开玻璃板,取出凝胶放入瓷盘中,加入固定液(注
意
要没过凝胶)缓缓水平摇动20分钟直至溴酚蓝和二甲苯蓝的颜色消失

洗胶:用双蒸水漂洗凝胶3次,每次2分钟(漂洗时轻轻摇动)
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 凝胶的染色:加入染色液缓缓摇动染色30分钟(25分钟后可在另一瓷盘中
备好显影液,同时要预冷到10℃)。

凝胶的漂洗和显影:
将染色液倒入一个容器内,将瓷盘用双蒸水涮一下,然后倒入双蒸水将凝
胶冲洗一下,再将凝胶立即放入准备好的预冷显影液中。(从胶浸入双蒸
水到放入显影液的时间不能超过5~10秒)。缓缓摇动,直到凝胶上显出条
带,一般为5~6分钟,时间不要过长,否则背景会过深(边摇动,边观
察,棕褐条带到一定强度后,马上终止,时间过长,会加深背景)。

终止显影:将等体积固定液直接加入显影液,缓缓摇动2~3分钟(时间过
长会使染色变淡)。

凝胶的漂洗:用双蒸水漂洗2次,每次2分钟
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试剂
Experiments of Molecular
1、溶液D:
4mol/L异硫氰酸胍
25mM柠檬酸钠
0.5%(W/V)SDS
0.1M巯基乙醇(现用现加)
2、固定液:10%冰乙酸
3、显影液:
在1000mL双蒸水中加入Na2CO3 30g,预冷至10℃,使用前加入1.5mL
37%甲醛和200uL硫代硫酸钠(10mg/mL)。
4、染色液(可在固定时配制)
1000mL双蒸水中加入AgNO3 1g,在使用前加入1.5mL 37%甲醛
5、6%变性聚丙烯酰胺凝胶贮液
尿素
63.06g
丙烯酰胺
8.5g
甲叉双丙烯酰胺
0.45g
5×TBE 15mL用双蒸水定容至150mL(用普通滤纸过滤后使用)
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Biology
核酸酶保护法mRNA定量
总RNA与标记的单链探针杂交

核酸酶消化单链RNA

沉淀被保护的双链核酸

聚丙烯酰胺/8mol/L尿素电泳

放射自显影

光密度扫描及软件分析

mRNA的相对丰度
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实时荧光定量PCR
 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,
最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法
 Ct值:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数
Ct值的确定
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Biology
 Ct值与起始模板的关系
Experiments of Molecular
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,
Ct值越小
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的
对数,纵坐标代Ct值
只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数(外
标准曲线定量的方法)
荧光定量标准曲线
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检测:荧光探针
 特异的寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团
 探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收
 PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光
基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号
 荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
TaqMan 荧光探针工作原理
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SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特
异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会
发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步
Ct值的重现性:
PCR循环在到达Ct值所在的循环
数时,刚刚进入真正的指数扩增
期(对数期),此时微小误差尚
未放大,因此Ct值的重现性极好,
即同一模板不同时间扩增或同一
时间不同管内扩增,得到的Ct值
是恒定的。迄今为止定量最准确,
重现性最好的定量方法
相同模板在同一台PCR仪上进行
96次扩增的扩增曲线图
终点处检测产物量不恒定,Ct值则极具重现性
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生物芯片技术

生物芯片技术是指通过微电子、微加工技术,在固体基质(如硅芯片、玻
片、瓷片等)表面构建的微型生物化学系统,以实现对细胞、蛋白质、核
酸及其它生物组分进行快速、敏感、高效地处理

主要实验步骤:样品制备、生物化学反应、检测和数据分析处理

分类:
DNA及寡聚核苷酸的微型阵列芯片(DNA芯片或基因芯片)
蛋白阵列(蛋白芯片)
其它芯片:如样品制备芯片、核酸扩增芯片、毛细管电泳芯片及多功能集
成的缩微芯片实验室(LOC)等
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基因芯片技术
 基因芯片技术是通过把巨大数量的寡核苷酸,肽核苷酸或cDNA固定在一块
面积很小的硅片、玻片或尼龙膜上而构成基因芯片
 基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化和自动化
 技术的基本步骤
1、基因芯片的制备:原位光蚀刻合成法、原位喷印合成 、点样法
2、样品的制备:提取血液或组织中的DNA/mRNA样本(进行一定程度的扩增以
便提高检测的灵敏度 ),用荧光素或同位素标记
3、杂交
4、放射自显影或激光共聚焦扫描杂交图谱
5、计算机软件处理分析,获得杂交信号的强度模式图,以此反映目的材料中
有关基因表达强弱的表达谱
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原位光蚀刻合成法
 在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个光敏保护基
 首先使支持物羟基化,并用光敏保护基团将其保护起来
 每次选取适当的蔽光膜使需要聚合的部位透光,其它部位不透光
 光通过蔽光膜照射到支持物上,受光部位的羟基脱保护而活化
 活化的基团与特定的单体分子发生偶联反应
 合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化,另一端受光敏保护基的保
护,所以发生偶联的部位反应后仍带有光敏保护基团
 每次通过控制蔽光膜的图案(透光与不透光)决定哪些区域应被活化,以及所用
单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的
 使用多种蔽光膜能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列,在合成循环中探针
数目呈指数增长,每次反应在成千上万个位点上添加一个特定的碱基
 具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点
 该技术只能合成30nt左右长度的寡核苷酸
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原位喷印合成法
 原理与喷墨打印类似,具有多个芯片喷印头和装有四种碱基的墨盒
 喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特
定的碱基喷印在芯片上特定位置
 该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致
 每步延伸的合成产率可以高达99%,合成的探针长度可以达到40~50nt
点样法:是将合成好的探针、cNDA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人
直接点在芯片上
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双色荧光系统
 将两个不同样品的mRNA在反转录时用不同的荧光底物进行标记
 两组样品的cDNA混合后进行杂交
 对同一个探针位点,在两组不同的激发光下进行检测,获得该位点上两个
不同样品的杂交信号
 其比值经阳性对照(外参照)比值和组成型表达基因(内参照)比值的校
正后,就是该基因在两个不同样品中差异表达的比值
 这类系统可以很好地克服检测过程某些不稳定或不确定因素带来的不利影
响,使差异性表达的研究高效而可靠
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基因芯片的应用
 基因表达分析
基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转
录情况。每对探针中,包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻
合的探针,这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。通过基因芯片
绘出基因表达的时空图谱,有助于人类认识生命活动过程和特征
1、分析基因表达时空特征:各种调节因子在基因上不同的作用位点和其作用的
分子机制通过基因芯片绘出基因表达的时空图谱,有助于人类认识生命活动
过程和特征
2、基因差异表达检测:对差异表达的研究,可以推断基因与基因的相互关系,
细胞分化中基因“开启”或“关闭”的机制;揭示基因与疾病的发生、发展、
转归的内在联系
3、发现新基因
4、大规模DNA测序
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 基因型、基因突变和多态性分析
 基因芯片中医学领域中的应用
 疾病的诊断与治疗
中药的研究
遗传病相关基因的定位
中医“证”本质的研究
肿瘤诊断
针灸原理研究
感染性疾病的诊断
 其它应用
耐药菌株和药敏检测
环境化学毒物的筛选
 药物研究中的应用
体质医学的研究
新药开发
调查药物处理后基因的表达情况
对药物进行毒性评价
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当前面临的困难
 样品制备
 探针的合成与固定比较复杂
 目标分子的标记
 目标分子与探针的杂交
 信号的获取与分析
 基因芯片的特异性还有待提高
 如何检测低丰度表达基因仍是目前一个重要问题
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蛋白质组学
 蛋白质组(Proteome):一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类
的蛋白质
 蛋白质组学(Proteomics):研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果
 蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周
围环境分子的关系
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 分类:表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学
 主要技术路线: LCM-二维电泳-质谱、LCM-抗体芯片、酵母双杂交和噬菌
体展示技术、蛋白质芯片
 研究内容:蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定、促进分子医学的
发展
 LCM(激光捕获微解剖Laser Capture Microdissection)技术可以精确地
从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型,因此LCM技术实际上是一种原
位技术
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二维电泳(双向2D):二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子
量差异进行高分辨率的分离
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 胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像
 通过分析软件对蛋白质点进行定量分析
 对感兴趣的蛋白质点进行定位
 通过专门的蛋白质点切割系统,可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割
 对胶中蛋白质进行酶切消化
 酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特
定的材料的表面(MALDI-TOF)
 这些蛋白质在质谱系统中进行分析,从而得到蛋白质的定性数据
 这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析
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酵母双杂交:在酵母中进行的研究活细胞内蛋白质相互作用的实验技术,对蛋
白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达敏感地检测得到,它是
一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术
应用:发现新基因、在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 、筛选药物的作
用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响、 建立基因组蛋白连锁图
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蛋白芯片
 将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检
测用的芯片
 用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用
 漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去
 利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术,测定芯片上各点的荧光强度
 通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系
 测定各种蛋白质的功能
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Liquichip液相蛋白芯片系统
 液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质构成,每种小球体上固定有
不同的探针分子,将这些小球体悬浮于一个液相体系中,就构成了一个液
相蛋白质芯片系统
 每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号
 在球形基质的制造过程当中,掺入了两种不同的红色分类荧光,根据这两
种红色分类荧光的比例不同,可以把球形基质分为100种
 利用这100种球形基质,可以标记上100种不同的探针分子
 在每个球形基质的表面进行了一系列的修饰,可适合各种蛋白,肽,核酸
等生物分子的固定
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检测的原理
 单个的球形基质通过检测通道,用双色激光同时对球形基质上的红色分
类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测
 红色激光激发的是球形基质上的红色分类荧光,根据球形基质的不同色
彩编号,可以将球形基质分类,从而将各个不同的分析反应区分开来
 绿色激光激发的是绿色报告荧光分子,目的是确定球形基质上结合的报
告荧光分子的数量,从而确定球形基质上结合的目的分子的数量
 通过红绿双色激光的同时检测,可以确定被结合的检测物的种类和数量
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液相蛋白芯片的应用
蛋白质组学研究、临床研究和药物研究中的各种蛋白质分析等
包括:
免疫分析
酶分析
受体-配基分析
蛋白质 -蛋白质相互作用分析
蛋白质- 核酸相互作用分析
特点:通量大、灵敏性好、操作简单、液相环境更有利于保持蛋白质的
天然构象,也更有利于探针和被检测物的反应等
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蛋白质组研究的新技术
 二维色谱 (2D-LC)、二维毛细管电泳 (2D-CE)、液相色谱-毛细管电泳
(LC-CE) 等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势
 质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用 (CE-MS) 蛋白质组生物
信息学
 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础