Reaktif Oksijen Türevleri Dost mu? Düşman mı?

Prof. Dr. Esat Orhon Gülhane Askeri Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Üremeye Yardımcı Teknikler Ünitesi

İki ucu keskin kılıç

• Fizyolojik dozlar • Hücre fonksiyonlarinin regülasyonu • Sinyal iletimi • Apoptozis • Aşırı dozlarda • Oksidatif stress.

Reaktif Oksijen Türevleri nedir? Serbest Radikal nedir?

• • •

Serbest radikal

elektron veya elektronlar içeren atom veya molekül : Çift oluşturamamış, tek kalmış Çift arayan bu elektronlar son derece yüksek enerjili olup, boşta kalmış tekli elektronlari çift oluşturmak üzere ararlar Bunlara

Reaktif Türevler

denmesinin nedeni, çift oluşturmak üzere yüksek enerjisi ile arayış içinde olan bu serbest radikaller, protein, lipid ve nükleik asit gibi biomoleküllerin yapısına girerek bozabilmeleridir.

Unpaired Electrons

Neler Reaktif Oksijen Türevidir?

• • • • • • • • • Süperoksid anyonu (O Hidroksil (OH) Güçlü oksidanlar : Hidrojen Peroksid (H 2 O 2 ) Peroksil radikalleri Alkoksil radikalleri Organik hidroperoksidleri Peroksinitrit Hipoklorik asid Nitrik oksid.

2 -.

)

Serbest Radikaller : Zincir Reaksiyonu üreticisi • • Biolojik sistemlerde, normalde sadece çift elektronlar vardır Serbest radikaller ise, zincir reaksiyonlara neden olurlar; • Ör : Biolojik membranlardaki lipidlerin peroksidasyonu • • • • • • • Plazma membranı üzerindeki doymamış yağ asidlerine ROS atağı olur Bu atağın sonucunda Peroksil ve Alkoksil açığa çıkar Bu radikaller, stabilize olabilmek için bir H + atomunu atarlar Böylece Organik hidroperoksidler ve Alkol oluşur Hidrojen atomunun atılması, bir başka lipid üzerinde karbonun oksijenle birleşmesi ve başka bir lipid peroksid oluşturmasıyla sonuçlanır Yeni oluşan lipid peroksid, stabilize olmak için bir H + zincir reaksiyon süreklilik kazanır atomunu atar, ve Sonuçta, plazma membranının peroksidatif hasarı oluşur.

Spermler neden Reaktif Oksijen Türevleri’nin hedefidir?

• • • • • Sperm membranı gerektiğinde sıvılaşabilmeli ve eriyebilmelidir Sperm – Oosit füzyonu için (akrozomal ekzositoz) bu gereklidir Bunu sağlayabilmek için sperm membranı doymamış yağ asitlerinden çok zengindir (22:6) Bu da, spermleri peroksidatif ataklara karşı savunmasız kılar Peroksidatif atak durdurulabilir mi?

• Zincir reaksiyonu durdurabilecek tek anti-oksidan,  -tokoferol (vit-E) • Yüksek lipid peroksidasyonu nedeniyle subfertil olan erkeklerde, fertilite bu tedavi fertiliteyi restore edebilir • Antioksidan tedavi, selektif olarak sadece oxidatif stress nedeniyle subfertil erkeklerde yararlıdır.

Erkek germ hücrelerinde ROS varlığı nasıl tespit edilir?

• Biolojik sistemlerde oksijen metabolitlerinin tespiti icin sensitif ve doğru sonuc veren bir test henüz yoktur.

• Aitken’in tanımladığı

lucigenin

yöntemi kullanılabilir veya

luminol

•

Lucigenin

membran impermeabldir. + taşır ve extraseluler aralıkta O 2 ion yükü ’e cevap verir • Kimyasal illuminesans testidir.

Sperm parametreleri ile lucigenin / luminol kimyasal illuminesans ilişkisi - 1 • • • Percoll gradient’in % 80-90’lık bölümünden alınan ve beyaz kürelerle kontamine olan spermlerdeki morfoloji bozukluğu, motilite defektleri ve sperm oosit füzyon kapasitesi, luminol peorksidaz ile çok yakın ilişkili bulunmuştur Bu test, gunumuzde sensitif olup, doğru sonuç veren tek test olarak önemini korumaktadır Ancak zor ve kompleks bir test olmanin yanisira, hassas olmasi nedeniyle bir çok faktörden etkilenebilmektedir • • • Ejakülasyon (kapasitasyon) – testin zaman aralığı Likefaksiyon : İyi likefiye omayan semenlerde test iyi sonuç vermiyor • • • • Bovin serum albumini : Poliamin oksidaz aktivitesi ile kontamindedir, ve seminakl plazma ile temas ederse, yanlış sinyal verir.

Santrifügasyon : ROS üretimini arttırır Ortam pH’ı : Test sonuçlarını çok yakından etkiler Kimyasal illuminesans interferansı : Bir çok kimyasal madde, luminol peroksidaz veya lucigenin etkileşimini artırır Lökositler : Ortamdaki lökosit varlığı, testi doğrudan etkiler.

Sperm parametreleri ile lucigenin / luminol kimyasal illuminesans ilişkisi - 2

Sperm parametreleri ile lucigenin / luminol kimyasal illuminesans ilişkisi – 3 • Yüksek redox aktivitesi gösteren defektif spermatozoalar, spermatogenik prosesteki sorunlarin varlığını ve H 2 O 2 üretme kapasiteleri hakkında bilgi veriyor • Baska arastirmalarla da konfirme edilen bu bulgu, semen kalitesinin ROS’un ana kaynağı olan sitoplazmik retansiyonların varlığını ve ilişkisini göstermiştir.

Oksidatif stresin spermatoza üzerine etkisi - 1 • İlk kez 1979 yılında bu konu dikkati çekmiştir • Jones et al, lipid peroksit varlığının ciddi motilite kaybına yol açtığını bulmuşlardır • Bu muhtemelen plasma membranının bütünlüğü ve gerektiğinde sıvılaşabilme özelliğine sakip olması ve bunun flagellar hareket ile yakın ilgisinden kaynaklanmaktadır.

Oksidatif stresin spermatoza üzerine etkisi - 2 • • • • • • • Oksidatif stres, aynı zamanda DNA hasarının da majör bir etkenidir PCR çalışmaları göstermiştir ki, mitokondrial DNA, nükleer DNA’dan daha fazla hasar görmektedir Sperm mitokondrial genomumunun integritesi, oksidatif stresin çok iyi bir göstergesidir Ancak bunun biolojik bir önemi yoktur çünkü biliyoruz ki sperm mitokondriası, fertilizasyondan sonra replike olmamaktadır Ve yine biliyoruz ki, nükleer kromatin spermatozoa içinde paketlenmiş durumdadır Bu nedenle, erkek gamet genomu, oksidatif strese karşı rezistandır Bunun doğru olduğunu şuradan da biliyoruz : Spermatozoa içindeki kromatinin paketlenmiş durumundan dolayı, DNA hasarı yapacak düzeydeki bir irradyasyonda, somatik hücreler etkilenirken, spermatozoa rezistan kalabilmektedir.

Erkek genom yapısı - 1

• • • • • • • Spermatozoanın diferansiyasyonu esnasında nükleer histonlar, daha küçük boyutlu olan protaminlerle (arginine ve cysteine) yer değiştirir Protaminler, küçük boyutlarından dolayı, çok küçük bir alan içinde paketlenebilirler Öteryan memelilerdeki spermindeki protaminler, epididmal transit sırasında, sistein rezidüleri taşırlar ve nükleer kromatin yapısını stabilize eden disülfid bağları oluşur Bu stabilizasyon, spem DNA’sını oksidatif strese karşı dayanıklı hale getirir Ancak öteryan memelileri içinde insan spermatozoası insan spermine has P2 protamini bulundurur, ve bu protaminin düsülfid bağları oluşturabilecek thiol grupları sınırlı sayıdadır Ayrıca insan sperminin protaminasyonu yüksek etkinliğe sahip değildir.

Fertil erkeklerde bile, genomun % 15’i histon yapısını korur.

Erkek genom yapısı – 2

• Sperm kromatin paketi ne kadar protamin hasarına karşı o kadar dirençli olur – disülfid bağlarıyla kuvvetli oluşturulursa, DNA • Testisler, insan spermatozoasındaki protaminizasyonu ne kadar defektif yaparsa, DNA hasar riski o kadar yükselir • Sperm kromatin paketi ne kadar protamin hasarına karşı o kadar dirençli olur.

– disülfid bağlarıyla kuvvetli oluşturulursa, DNA

Erkek genom yapısı ve Oksidatif stresin spermatoza üzerine etkisi • • • • Her ne kadar teorik olarak insan spermatozoası oksidatif DNA hasarına karşı dayanıklı gibi görünse de, somatik hücrelere kıyasla daha fazla hasarlanırlar Bunun tek açıklaması erkek toksikolojisinde yatar • • • İlerleyen yaşın olumsuz etkisi Meslek hastalıkları Sigara Oksidatif stres, doğrudan mutageik değişikliklere neden olmaz, daha ziyade non spesifik hasar yaratırlar (nükleotidler arası bağ kırılmaları, DNA bazlarında değişiklikler, baz içermeyen alanlar) Oksidatif stres, plazma membranı üzerine de peroksidatif stres yaratır.

DNA hasarının genetik mutasyonlara yol açması • • • • Sperm DNA hasarı yüksek olan erkeklerin çocuklarında daha fazla kanser, şizofreni, dominant genetik mutasyonlar görülmektedir DNA hasarı yüksek spermlerle elde edilen gebeliklerde, infertilite ve tekrarlayan gebelik kayıpları da daha sık görülmektedir Aslinda erkek germ hücrelerinde spontan genetik mutasyonlar oldukça düşüktür Paternal kökenli patolojiler, erken embryo dönemindeki DNA onarımının aberan (sorunlu) olmasındandır.

DNA hasarının fertiliteye etkileri

• • • • • Okisdatif stresin yüksek düzeylerinde, spermatozoanın fertilizasyon kapasitesi kaybolur Oksidatif stresin düşük düzeylerinde, oosit sperm tarafından fertilize edilebilir. Ancak bu durumda, birinci klivajdan önce, hasarlı DNA oosit tarafından onarılmak zorundadır Oosit vücudun en büyük hücresidir ve rekombinan bir fabrikadır.

Embryo döneminde sperm DNA erken fragmantasyonlarını onarabilir Eğer sperm DNA fragmantasyonları % 30’u aşacak olursa, bu oositin onarma kapasitesini aşar.

Defektif sperm üretilmesine yol açan oksidatif stresin kaynağı nedir? - 1 • • • • • Serbest radikal üreten lökositler : Nötrofiller Eğer nötrofiller sekonder (aksesuar) seks organlarından (prostat, seminal veziküller) kaynaklanıyorsa, seminal plazmanın güçlü anti-oksidan özelliği spermleri korur • • • • Askorbik asid Ürik asid Süperoksid dismutaz Glutatyon peroksidaz Eğer nötrofiller normal konsantrasyonda olursa, (~ 40,000/mL) seminal plazmanın koruyucu etkisi yeterli olur Ancak, eğer spermler, yoğun bir ortamda fazla miktarda nötrofillerle yan yana bulunurlarsa, ve seminal plazma da bu ortamda yok ise, o zaman oksidatif stres etkili olur ve genomik bütünlük bozulabilir Santrifügasyon buna tipik bir örnektir.

Defektif sperm üretilmesine yol açan oksidatif stresin kaynağı nedir? – 2 • Eğer nötrofiller vaz deferensten daha proksimal bir bölgeden erkek genital traktusuna girmişlerse, (testisler, vaz deferens) spermatozoaya oksidatif stres yaratacakları kuşkusuzdur • Bu durumda küçük konsatntrasyonlardaki nötrofiller dahi hasar yaratabilir.

Reaktif oksijen türevlerinin fizyolojik rolü nedir?

• Eğer ROS spermatozoa üzerine bu derece zaralı ise, neden hücrelerimiz yüksek reaktiviteye sahip moleküller oluşturmaktadır?

• Bunun cevabı çok iyi bilinmemekle birlikte cevabın, memeli spermatozoasının kapasitasyonunda yattığı düşünülmektedir • Kapasitasyon spermin matürasyonudur. Ancak bu matürasyon gerçekleşirse sperm – oosit interaksiyonu oluşabilir.

Kapasitasyon nedir? ROS’un yararı nedir?

• • • • • Kapasitasyonun en karakteristik özelliği trozin fosforilasyonu’nun dramatik düzeyde artmasıdır Bunun sinyali cAMP tarafından verilir ROS, intraselüler adenil siklaz aktivitesini stimüle eder Ayrica ROS, özellikle H 2 O 2 , tirozin fosfataz aktivitesini süprese ederek, tirozin fosforilasyonunu arttırır H 2 O 2 bunu sistein üzerinden yapar. H 2 O 2 , tirozin fosfataz ile karşılaşırsa, emzimin içinde bulunan sisteini okside ederek tirozin fosfatazı dramatik bir sekilde inhibe eder.

H

2

O

2

yararlı mıdır?

• • • • • • • • • Eğer H 2 O 2 doğrudan insan semeni üzerine ilave edilirse, tirozin fosforilasyonu ve kapasitasyon stimüle olur Ortama katalaz ilave edilirse, bu reaksiyon geri döner Katalaz, tirozin fosforilasyonunu inhibe eder Katalaz, ayni zamanda sperm hiperaktivasyonunu, akrozom reaksiyonunu ve sperm oosit füzyonunu süprese eder Spermlerin bulundugu ortama lökosit ilave edilecek olursa, yine kapasitasyon stimule olur Bu reaksiyon da, seminal plazmada bulunan anti-oksidanlarla geri dondurulebilir Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH)’da tirozin fosforilasyonunu ve sperm kapasitasyonunu arttırır Ortama NADPH ilave edilirse, O 2 -.

üretimi olmamaktadır Ortama katalaz ilave edilirse, NADPH’ın tirozin fosforilasyonunu arttirici etkis ve kapasitasyon başlatıcı etkisi inhibe olur.

NADPH nedir?

• Heksoz monofosfat varlıgında üretilir • NADPH oksidaz, ROS üretimine yol açar • Gerek kapasitasyon ve gerekse ROS üretiminin her ikisi de glukoz varlığında mümkündür • Gerek kapasitasyon ve gerekse ROS üretiminin her ikisi de glukoz analoğu ile bloke edilebilir • Glukoz 6 PDH, ROS üretimini arttır, heksoz monofosfat üretimini kontrol eder.

Olgun spermatozoa nedir?

• Olgun spermatozoa, minimal sitoplazma içerir • Minimal sitoplazma sınırlı miktarlarda ROS üretimi yapar.

• İmmatür spermatozoa gereğinden fazla sitoplazma bulunduracağı için, gereğinden fazla NADPH ve ROS üretimi olur

ÖZET

 ROS  intraselüler cAMP + NADPH  tirozin fosforilasyonu  kapasitasyon ➨ ROS ➨ plazma membraınındaki doymamış yağ asitlerinin lipid peroksidasyonu ➨ ➨ Membran fonksiyonlarıyla ilgili tüm görevlerde bozulma (motilite, sperm oosit füzyonu) + Nükleer DNA ve mitokondrial DNA hasarı ➨ Subfertilite + Tekrarlayan gebelik kayıpları